聚l-谷氨酸-殼聚糖材料在脂肪組織工程以膽管癌三維培養(yǎng)模型中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分聚L-谷氨酸/殼聚糖材料在脂肪組織工程中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的
　　 每年全世界有數(shù)百萬(wàn)的患者因創(chuàng)傷、腫瘤切除手術(shù)和先天性發(fā)育缺陷等原因會(huì)導(dǎo)致的大面積軟組織缺損，大范圍的軟組織缺損是無(wú)法自愈的，需要通過(guò)手術(shù)進(jìn)行等方法修復(fù)重建。組織修復(fù)重建的主要目的不僅僅是恢復(fù)正常的組織結(jié)構(gòu)，更重要的是通過(guò)對(duì)缺損的修復(fù)，恢復(fù)正常的組織功能，減輕患者焦慮、自卑等不良心理。
　　 傳統(tǒng)的軟組織修復(fù)重建方法主要包括游離脂肪移

2、植，復(fù)合組織瓣移植或人工合成替代物的植入等方式，它們都存在著各自的缺點(diǎn)，如游離脂肪移植成活率低、容易吸收(體積降低40％-60％);復(fù)合組織瓣移植，對(duì)供區(qū)組織損傷大，操作復(fù)雜，不易塑形;人工合成替代物，如硅膠等可能會(huì)引起機(jī)體不同程度的排異反應(yīng)，長(zhǎng)期效果可能不理想。
　　 隨著細(xì)胞生物學(xué)與生物材料科學(xué)的發(fā)展，以種子細(xì)胞、支架材料構(gòu)建組織為基本特征的組織工程學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，為解決軟組織乃至器官缺損提供了新的思路。脂肪組織工程的基本策略就

3、是利用種子細(xì)胞與具有生物相容性和生物降解性的生物材料結(jié)合經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)構(gòu)建脂肪組織。成功構(gòu)建組織工程化脂肪的關(guān)鍵在于:①種子細(xì)胞的選擇和獲得;②具有良好生物降解性和組織相容性的三維支架材料;③種子細(xì)胞增殖和分化的微環(huán)境。
　　 本實(shí)驗(yàn)以人脂肪干細(xì)胞(adiposetissue-derivedadultstemcells，ADSC)作為種子細(xì)胞，以水溶性聚L-谷氨酸/殼聚糖(poly[L-glutamicacid]/chitos

4、an，PLGA/CS)靜電絡(luò)合而成的新型多孔材料作為支架材料，構(gòu)建組織工程化脂肪。探討新型支架材料聚L-谷氨酸/殼聚糖的細(xì)胞相容性及與ADSC體外及體內(nèi)成脂的狀況，證實(shí)人ADSC能夠在水溶性聚L-谷氨酸/殼聚糖支架材料上構(gòu)建組織工程化脂肪，為脂肪組織工程增添新的內(nèi)容。
　　 方法
　　 一、人脂肪干細(xì)胞體外成脂分化潛能的研究
　　 1.應(yīng)用酶消化法從吸脂手術(shù)的患者中獲取新鮮脂肪組織，提取ADSCs，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，

5、取第3代ADSCs用于實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs分化群表面抗原CD13、CD14、CD34、CD44、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106和CD166的表達(dá)。
　　 3.利用不同的生長(zhǎng)因子體外誘導(dǎo)，對(duì)ADSCs成骨、成脂、成軟骨三向分化性能進(jìn)行鑒定。
　　 4.體外誘導(dǎo)ADSCs成脂分化21天，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Oil-redO染色及其定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況。

6、　　 二、ADSCs于PLGA/CS支架材料體外成脂的研究
　　 1.以聚乳酸PLA微球（直徑在200-300μm）作為致孔劑，利用冷凍干燥技術(shù)和靜電絡(luò)合技術(shù)制成球形孔結(jié)構(gòu)的PLGA/CS支架材料。
　　 2.用掃描電鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）和熒光染料DiL標(biāo)記的方法定性檢測(cè)ADSCs在PLGA/CS支架材料上粘附和增殖情況。
　　 3.通過(guò)Hoechst33258染色

7、的DNA定量方法，繪制成脂分化誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組的ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖曲線。
　　 4.通過(guò)定量檢測(cè)細(xì)胞/材料復(fù)合物乳酸脫氫酶的釋放，評(píng)價(jià)PLGA/CS材料對(duì)ADSCs的細(xì)胞毒性。
　　 5.用Oil-redO染色法，定量檢測(cè)ADSCs接種到PLGA/CS材料經(jīng)成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，并與未誘導(dǎo)組進(jìn)行對(duì)比。
　　 6.用RT-PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組的ADSCs接種PLGA/CS支架

8、材料后的脂特異性基因的表達(dá)情況，包括過(guò)氧化物酶體增生物激活物受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma2，PPARγ2)、脂肪酸結(jié)合蛋白（fattyacid-bindingprotein，aP2）、脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase，LPL)、脂連接蛋白(adiponectin)。
　　 三、ADSCs在PLGA/CS支架材料體內(nèi)成脂研究
　　 以ADS

9、C接種在PLGA/CS支架材上后體外成脂誘導(dǎo)2周為實(shí)驗(yàn)組，以空白PLGA/CS支架材料為對(duì)照組。12只SCID裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料分別移植于裸鼠皮下。移植6周后取出植入物，測(cè)量其體積變化來(lái)觀察PLGA/CS支架材料降解情況;OCT包埋進(jìn)行冰凍切片，Oil-redO染色檢測(cè)其脂肪形成情況。
　　 結(jié)果
　　 1.成功的從脂肪抽吸術(shù)獲取的新鮮脂肪組織中，原代培養(yǎng)出ADSCs，細(xì)胞活性良好，增殖旺盛

10、。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所用P3ADSCs的CD13、CD34、CD44、CD90、CD105、CD166以及CD49d陽(yáng)性表達(dá)，CD14、CD45與CD31陰性表達(dá);鑒定結(jié)果顯示其具有成骨、成軟骨和成脂的三向分化潛能。成脂誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)由“長(zhǎng)梭形”向圓形脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，Oil-redO染色及其定量測(cè)定顯示隨時(shí)間增加，細(xì)胞內(nèi)脂滴形成逐漸增多。
　　 2.PLGA/CS材料外觀呈多孔海綿狀，孔徑均一，孔間連通性良好，孔

11、隙率＞90％，對(duì)ADSCs顯示出良好的細(xì)胞相容性;SEM與DiL染色的共聚焦顯微鏡觀察顯示ADSCs于PLGA/CS支架材料上粘附、增殖良好;PLGA/CS支架材料的細(xì)胞毒性對(duì)接種的ADSCs影響不大。Oil-redO染色及其定量檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組脂滴累積明顯高于對(duì)照組;RT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組成脂特異性基因表達(dá)均增加，且明顯高于對(duì)照組。
　　 3.裸鼠體內(nèi)移植物6周后取出，可見(jiàn)移植物體積完整，有明顯的血管長(zhǎng)入;體積測(cè)量結(jié)果顯示

12、，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體積均有不同程度降低，分別為初始體積的90.5％和82.3％，兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。冰凍切片Oil-redO染色顯示實(shí)驗(yàn)組有新生脂肪形成，而對(duì)照組沒(méi)有。
　　 結(jié)論
　　 1.ADSCs具有成脂分化潛能，是脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞。
　　 2.ADSCs在PLGA/CS支架材料上能較好粘附、增殖以及體外和體內(nèi)的成脂分化，說(shuō)明PLGA/CS支架材料對(duì)ADSCs具有良好的生物相容性

13、和促成脂分化的潛能，表明PLGA/CS可能是一種理想的脂肪組織工程細(xì)胞支架材料。
　　 3.PLGA/CS支架材料在裸鼠體內(nèi)可以降解，表明其具有生物可降解性，但材料的降解率與體內(nèi)脂肪形成的動(dòng)力學(xué)關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。
　　 創(chuàng)新性及研究的意義
　　 本研究首次將聚L-谷氨酸/殼聚糖靜電絡(luò)合而成的支架材料應(yīng)用于脂肪組織工程中研究，成功的完成了ADSCs在PLGA/CS支架材料上體外和體內(nèi)脂肪組織的構(gòu)建，為組織工程支

14、架以及整個(gè)脂肪組織工程的發(fā)展增加了新的實(shí)驗(yàn)資料。
　　 第二部分聚L-谷氨酸/殼聚糖材料在膽管癌三維培養(yǎng)模型中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的
　　 膽管癌（Cholangiocarcinoma,CC）泛指起源于膽管上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率僅低于肝細(xì)胞肝癌，排在肝膽系統(tǒng)腫瘤中的第二位。根據(jù)解剖部位不同，膽管癌可分為肝外膽管癌和肝內(nèi)膽管癌。由于膽管癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，發(fā)病時(shí)已近中晚期，手術(shù)切除治愈率低，預(yù)后不良。<

15、br>　　 流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)膽管癌的發(fā)病率明顯有升高趨勢(shì)，逐漸成為重要的惡性腫瘤致死的病因，日益受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越廣泛的關(guān)注。盡管診斷和治療方法不斷的進(jìn)步，膽管癌的預(yù)后依然不容樂(lè)觀。建立適宜的研究模型，充分了解膽管癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)膽管癌的治療和預(yù)后改善具有重要意義。
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialtomesenchymaltransition，EMT）是指細(xì)胞從上皮形態(tài)到間質(zhì)成纖維形態(tài)的轉(zhuǎn)化過(guò)程

16、，主要表現(xiàn)為上皮特點(diǎn)的失去和移動(dòng)能力的獲得。其重要的改變包括E-鈣粘素（E-cadherin）介導(dǎo)的細(xì)胞間粘連、其他上皮標(biāo)記和細(xì)胞極性的喪失，同時(shí)伴隨著移動(dòng)能力的獲得和細(xì)胞骨架重組。EMT不僅發(fā)生在胚胎形成早期和器官組織慢性纖維化過(guò)程中，也發(fā)生在腫瘤局部侵襲，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和藥物抵抗的過(guò)程中。腫瘤的浸潤(rùn)過(guò)程，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，彼此分離，移動(dòng)入基底膜，侵襲到臨近的結(jié)締組織中。目前已證實(shí)很多腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移都是通過(guò)EMT實(shí)現(xiàn)的，如乳腺癌、卵巢癌

17、、肺癌，膽管癌等。EMT的過(guò)程受到很多環(huán)境因素和信號(hào)通路的調(diào)控。在這些信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)是EMT發(fā)生及腫瘤和其他病理現(xiàn)象發(fā)展中最重要的誘導(dǎo)因子。
　　 本研究中，我們首先在二維(twodimensional，2D)模型中探討了TGF-β1對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞HCCC9810EMT過(guò)程的影響，然后利用PLGA/CS體外建立腫瘤細(xì)胞三維(threedimens

18、ional,3D)培養(yǎng)模型，觀察了3D模型對(duì)HCCC9810細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及侵襲能力的影響，不僅為膽管癌的基因治療提供了靶點(diǎn)，同時(shí)將組織工程理念引領(lǐng)到腫瘤研究中，為腫瘤的生物學(xué)特性和治療方法的研究提供了新的思路。
　　 方法
　　 1.以TGF-β110ng/ml濃度體外2D誘導(dǎo)HCCC9810細(xì)胞，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，正常生長(zhǎng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的HCCC9810細(xì)胞為對(duì)照組，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化;用體外劃痕試驗(yàn)(wound

19、healingassay)檢測(cè)細(xì)胞移動(dòng)能力的改變;免疫熒光定性檢測(cè)上皮特性指標(biāo)，包括E-cadherin、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和角蛋白(Pan-cytokeratins，Pan-CK)，以及間質(zhì)特性指標(biāo)，包括波形蛋白(Vimentin)和纖維粘連蛋白（Fibronectin）的變化以及骨架蛋白F-actin的重組情況;WB和real-timePCR法檢測(cè)上皮和間質(zhì)特性指標(biāo)的蛋白和mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 2.

20、將HCCC9810細(xì)胞接種于PLGA/CS材料上，建立PLGA/CS膽管癌三維培養(yǎng)模型，用SEM和熒光染料DiL標(biāo)記的方法定性檢測(cè)HCCC9810細(xì)胞在PLGA/CS材料上粘附和生長(zhǎng)情況;用Hoechst33528染色DNA定量檢測(cè)HCCC9810細(xì)胞在PLGA/CS材料上的增殖情況，并與2D結(jié)果進(jìn)行對(duì)比;用real-timePCR法檢測(cè)上皮特性指標(biāo)（包括E-cadherin和β-catenin）和間質(zhì)特性指標(biāo)（Fibronectin、

21、Vimentin和N-鈣粘素[N-cadherin]）以及TGF-β1的mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果
　　 1.體外2D培養(yǎng)下，TGF-β1誘導(dǎo)HCCC9810細(xì)胞逐漸失去上皮“鋪路石”形狀，轉(zhuǎn)化成成纖維樣“長(zhǎng)梭形”形狀;劃痕試驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞獲得移動(dòng)能力;免疫熒光結(jié)果顯示膽管癌細(xì)胞不表達(dá)E-cadherin，而β-catenin由誘導(dǎo)前細(xì)胞膜表達(dá)變成誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)中也有表達(dá)，Pan-CK誘導(dǎo)后表達(dá)降低;誘導(dǎo)后間質(zhì)細(xì)胞

22、標(biāo)志Vimentin和Fibronectin明顯增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞骨架蛋白F-actin發(fā)生重組;WB結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞特性標(biāo)志中，E-cadherin無(wú)表達(dá)，β-catenin和Pan-CK誘導(dǎo)后表達(dá)不同程度降低，而間質(zhì)細(xì)胞特性標(biāo)志中，Vimentin和Fibronectin表達(dá)明顯增加，N-cadherin表達(dá)未有明顯變化;real-timePCR結(jié)果顯示mRNA水平上皮細(xì)胞特性標(biāo)志中，E-cadherin和β-catenin誘導(dǎo)后表達(dá)

23、顯著性降低，間質(zhì)細(xì)胞特性標(biāo)志Vimentin，F(xiàn)ibronectin和N-cadherin均不同程度增加，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2.HCCC9810細(xì)胞接種在PLGA/CS材料上表現(xiàn)為粘附、增殖良好;DNA定量檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞于材料上的增殖速率較2D培養(yǎng)速度降低，這更加符合腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的真實(shí)情況;real-timePCR結(jié)果顯示，細(xì)胞接種材料后，E-cadherin和β-catenin的mRNA表達(dá)隨時(shí)間逐漸

24、降低，第21天表達(dá)顯著降低(p＜0.05)，F(xiàn)ibronectin和vimentin于細(xì)胞接種材料后14天和21天mRNA表達(dá)明顯增高(p＜0.05);N-cadherin的mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯變化;TGF-β1的mRNA水平于細(xì)胞接種材料14天和21天后表達(dá)明顯增加(p＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.TGF-β1能夠誘導(dǎo)膽管癌發(fā)生EMT，證實(shí)TGF-β1及其信號(hào)通路在膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有揮重要作用，可作為膽管

25、癌基因治療的靶點(diǎn)。
　　 2.組織工程支架材料PLGA/CS可用于體外3D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立，較傳統(tǒng)2D培養(yǎng)模式更真實(shí)的反應(yīng)腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)情況，且長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞自分泌TGF-β1，使細(xì)胞移動(dòng)和侵襲能力增加，符合膽管癌體內(nèi)自分泌或旁分泌TGF-β1實(shí)現(xiàn)局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。
　　 創(chuàng)新性及研究意義
　　 1.證實(shí)了TGF-β1能夠誘導(dǎo)膽管癌發(fā)生EMT，提出TGF-β1可作為膽管癌基因治療的靶點(diǎn);