成釉細(xì)胞瘤中mTOR及其調(diào)控相關(guān)基因的研究.pdf

1、成釉細(xì)胞瘤(ameloblastomas，ABs)是發(fā)生于頜骨的良性的牙源性腫瘤，在中國，其發(fā)生約占牙源性腫瘤的36％。腫瘤內(nèi)主要含成釉器樣結(jié)構(gòu)，但無釉質(zhì)或其他牙體硬組織形成。大多數(shù)腫瘤發(fā)生于頜骨內(nèi)，常導(dǎo)致頜骨的膨大和面部變形。ABs雖然為良性腫瘤，與其它良性牙源性腫瘤相比，ABs術(shù)后復(fù)發(fā)幾率要較其他良性腫瘤高。WH02005年新分類將ABs分為4種臨床病理行為不同的變異型，包括：實(shí)性/多囊型、骨外/外周型、促結(jié)締組織增生型和單囊型。這

2、些亞型在患者年齡、部位、影像學(xué)表現(xiàn)以及臨床預(yù)后等方面均存在差異，以往對(duì)于其治療多采用刮除術(shù)，由于其復(fù)發(fā)幾率較大，所以目前多以擴(kuò)大切除術(shù)為主，但仍有小部分患者有復(fù)發(fā)傾向。成釉細(xì)胞瘤的局部侵襲性生長是術(shù)后容易復(fù)發(fā)的主要原因，其侵襲機(jī)制也是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)及熱點(diǎn)。近年來，對(duì)ABs侵襲性研究主要集中在基因和蛋白兩個(gè)水平，主要在細(xì)胞增殖、凋亡、基質(zhì)降解以及癌基因，抑癌基因等幾個(gè)方面。mTOR通路是與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的信號(hào)傳導(dǎo)通路之

3、一。近來，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路控制著眾多在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要的細(xì)胞生物學(xué)過程，包括對(duì)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細(xì)胞周期的調(diào)控等。該通路在遺傳學(xué)上的改變和生化條件引起的激活經(jīng)常發(fā)生在惡變?cè)缙诤湍[瘤進(jìn)展期，同時(shí)，該信號(hào)通路激活程度也是判斷腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)。因此抑制該信號(hào)通路已成為腫瘤預(yù)防和腫瘤靶向治療的熱點(diǎn)。但其在牙源性腫瘤中的表達(dá)情況少有報(bào)道。我們?cè)谇捌诘墓ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)mTOR上游的調(diào)控因子

4、之一 AKT在成釉細(xì)胞瘤中存在著強(qiáng)陽性表達(dá)，而mTOR極其調(diào)控基因在成釉細(xì)胞瘤中表達(dá)也僅有一位美國學(xué)者用免疫組化的方法對(duì)32例成釉細(xì)胞瘤進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)其在成釉細(xì)胞瘤中存在著陽性表達(dá)，TSC1是mTOR通路的重要調(diào)控因子，是腫瘤的抑制基因，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western-blot及免疫組化方法對(duì)ABs中mTOR及其調(diào)控基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，用PCR直接測(cè)序法對(duì)TSC1進(jìn)行突變篩查，從而進(jìn)一步探討mTOR極其調(diào)控基因在ABs

5、發(fā)生、發(fā)展及侵襲中的作用。
　　 材料與方法：
　　 30例ABs樣本均來自2007年至2010年在中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科和病理科，新鮮手術(shù)標(biāo)本-86℃凍存。診斷標(biāo)準(zhǔn)依WHO2005分類標(biāo)準(zhǔn)。以正常黏膜做對(duì)照，用Real-time PCR方法，以管家基因β-actin校正，檢測(cè)ABs中mTOR及4E-BP1，P70S6K，TSC1mRNA表達(dá)情況：用Western-blot方法，以β-tublin做內(nèi)參，檢測(cè)mTO

6、R及4E-BP1，p70S6K，極其磷酸化的活化形式的蛋白表達(dá)；擴(kuò)大樣本至85例用免疫組化SP法觀察mTOR，4E-BP1，P70S6K，極其磷酸化的活化形式，TSC1在ABs瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，以了解TSC1，mTOR，4E-BP1，P70S6K在ABs表達(dá)情況。進(jìn)一步通過PCR結(jié)合直接測(cè)序法篩查TSC1突變情況，深入探討在ABs中mTOR及其調(diào)控基因的表達(dá)機(jī)制，及其對(duì)ABs侵襲性的影響，進(jìn)而為ABs診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

7、　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、ABs中mTOR，4E-BP1，P70S6KmRNA水平表達(dá)結(jié)果
　　 用Real-time PCR方法，以β-actin做內(nèi)參，檢測(cè)了30例ABs中mTOR及其下游因子4E-BP1，P70S6KmRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示ABs中mTOR mRNA表達(dá)在ABs中表達(dá)相對(duì)于黏膜組織中高了1.77倍。4E-BP1其表達(dá)水平正常黏膜高2.53倍。P70S6K其表達(dá)水平正常黏膜高4.88倍。

8、　　 二、ABs中mTOR，p70S6K及其磷酸化的mTOR，4E-BP1，p70S6K蛋白表達(dá)結(jié)果
　　 用Western-blot方法，以β-tublin做內(nèi)參，檢測(cè)了30例ABs中mTOR，4E-BP1，P70S6K及其p-mTOR，p-p70S6K蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，mTOR在ABs(1.06±0.53)中的表達(dá)顯著高于正常黏膜(0.22±0.05)中的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p-mTOR在ABs(1

9、.27±0.57)中的表達(dá)顯著高于正常黏膜(0.12±0.05)中的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，p-4E-BP1在ABs(1.39±0.68)中的表達(dá)略高于正常黏膜(1.23±0.25)中的表達(dá)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，p70S6K在ABs(0.75±0.93)中的表達(dá)顯著高于正常黏膜(0.41±0.05)中的表達(dá)，兩者表達(dá)也無顯著差別(P>0.05)p-p70S6K在ABs(1.37±0.44)中的表達(dá)顯著高于

10、正常黏膜(0.00)中的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在ABs的原發(fā)組和復(fù)發(fā)組之間，mTOR，p-mTOR無顯著差異(P>0.05)，p-4E-BP1，p70S6K，p-p70S6K蛋白表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)。
　　 三、ABs中mTOR，4E-BP1，p70S6K，三者磷酸化形式免疫組化結(jié)果
　　 mTOR在正?？谇火つど掀ぜ?xì)胞膜為陰性表達(dá)，在ABs中胞漿的異位表達(dá)，p-mTOR在正?？谇火つど掀ぜ?xì)胞

11、膜上有完整表達(dá)，在ABs中有胞漿及胞核的異位表達(dá)，其中胞核陽性為27例(32%)，胞漿陽性為47例(55.3%)。4EBP-1在口腔黏膜胞漿及胞核存在陽性表達(dá)，在ABs中4EBP-1為強(qiáng)陽性表達(dá)，定位于胞漿與胞核中，p-4EBP-1在ABs中有胞漿及胞核的異位表達(dá)，其中胞核陽性為23例(27%)，胞漿陽性為55例(64.7%)。p70S6K在正?？谇火つど掀ぜ?xì)胞為陰性表達(dá)，在ABs中胞漿胞核的異位表達(dá)，p-p70S6K在ABs中有胞漿及

12、胞核的異位表達(dá)，其中胞核陽性為33例(38.8%)，胞漿陽性為45例(52.9%)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三者(磷酸化形式)細(xì)胞核表達(dá)在復(fù)發(fā)組顯著高于原發(fā)組，x2分別為43.275，41.150，19.296，P<0.0001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-mTOR，p-4E-BP1，p-p70S6K細(xì)胞核表達(dá)可能與ABs的侵襲行為相關(guān)，cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果顯示p-mTOR對(duì)復(fù)發(fā)有影響，OR值是6.417，95%CI是1.428-28.8

13、24，pmTOR核表達(dá)復(fù)發(fā)危險(xiǎn)是漿表達(dá)的6.417倍。
　　 四、TSC1在ABs中表達(dá)及基因突變篩查結(jié)果
　　 以正常人群做對(duì)照，用免疫組化及RT-PCR方法檢測(cè)TSC1在ABs中的表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示，85例樣本中TSC1呈弱陽性表達(dá)，較強(qiáng)陽性表達(dá)的口腔黏膜染色強(qiáng)度弱，在mRNA水平上TSC1呈下調(diào)表達(dá)，是正常黏膜的0.66倍，且在突變樣本中TSC1表達(dá)水平更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PCR結(jié)合直接測(cè)序

14、法檢測(cè)了TSC1基因全部23個(gè)外顯子突變情況，結(jié)果顯示，在20例樣品中，有9例樣品5個(gè)外顯子發(fā)生了錯(cuò)義突變，分別是TSC1-3、TSC1-5、TSC1-18、TSC1-19、TSC1-22發(fā)生了非SNP位點(diǎn)的錯(cuò)義突變，突變率為45%(9/20)。對(duì)照組未見有異常。
　　 結(jié)論：
　　 1、ABs中mTOR、4E-BP1、p70S6K基因在mRNA、蛋白質(zhì)水平在上表達(dá)上調(diào)，并且mTOR、4E-BP1、p70S6K均有胞漿及

15、核異常表達(dá)，提示mTOR、4E-BP1和p70S6K基因在ABs的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的功能。
　　 2、mTOR細(xì)胞核表達(dá)與ABs侵襲性生物學(xué)行為相關(guān)，p-mTOR是ABs獨(dú)立預(yù)后因子，p-mTOR的細(xì)胞核表達(dá)復(fù)發(fā)的幾率是胞漿表達(dá)的6.417倍。
　　 3、4E-BP1、p70S6K、p-p70S6K細(xì)胞核表達(dá)與ABs侵襲性生物學(xué)行為相關(guān)，且復(fù)發(fā)組蛋白表達(dá)水平顯著高于原發(fā)組蛋白表達(dá)，4E-BP1、p70S6K可能與AB