饑餓狀態(tài)對(duì)白色念珠菌生物膜滯留菌的影響及滯留菌相關(guān)基因的單細(xì)胞分析.pdf

1、目的：
　　作為人類最常見的條件致病菌——白色念珠菌（Candidaalbicans），所引起的感染性疾病大都是慢性和難治性的，這與其形成的生物膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。白色念珠菌生物膜高耐藥性的可能機(jī)制有:生物膜基質(zhì)對(duì)藥物的空間位阻和屏障作用;生物膜中白色念珠菌的特殊生長(zhǎng)狀態(tài)，例如遲緩生長(zhǎng)狀態(tài);基因水平的耐藥機(jī)制;生物被膜內(nèi)細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)成分的影響;以及近幾年提出的‘滯留菌’的產(chǎn)生等等。越來越多的研究提示，正是滯留菌(Persisters)

2、的存在，使得藥物無法完全清除白色念珠菌生物膜，對(duì)慢性遷延性感染的產(chǎn)生起到了關(guān)鍵性的作用。
　　已有研究證實(shí)了細(xì)菌滯留菌的產(chǎn)生機(jī)制主要包括以下2個(gè)方面:微生物群體中生長(zhǎng)速度的異質(zhì)性，極少數(shù)生長(zhǎng)處于靜止?fàn)顟B(tài)的菌細(xì)胞亞群成為滯留菌;饑餓等環(huán)境因素導(dǎo)致的SOS反應(yīng)，即極端不利環(huán)境因素誘導(dǎo)。這表明滯留菌的產(chǎn)生機(jī)制，并非單一的由生長(zhǎng)狀態(tài)異質(zhì)性造成的，而是與環(huán)境因素的誘導(dǎo)也有密切關(guān)系。那么，改變生物膜代謝的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，是不是也會(huì)對(duì)白色念珠菌耐藥滯

3、留菌的產(chǎn)生有一定的影響呢？
　　本實(shí)驗(yàn)即通過研究饑餓環(huán)境對(duì)白色念珠菌生物膜以及其耐藥滯留菌形成的影響，證實(shí)白色念珠菌生物膜耐藥滯留菌形成的第二種機(jī)制（環(huán)境因素影響機(jī)制）;并且，進(jìn)一步運(yùn)用基于Taqman探針的單細(xì)胞real-timeRT-PCR技術(shù)相對(duì)定量檢測(cè)滯留菌相關(guān)基因，為今后白色念珠菌耐藥滯留菌相關(guān)基因的研究提供方便、可行的研究技術(shù)。
　　材料和方法：
　　(1)饑餓狀態(tài)對(duì)白色念珠菌生物膜及其耐藥滯留菌形成的影響

4、
　　體外分別構(gòu)建對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和饑餓狀態(tài)白色念珠菌生物膜模型，兩性霉素B(AmB)沖擊作用24h，沖擊前后均進(jìn)行活菌菌落計(jì)數(shù)(CFU)，計(jì)算得出滯留菌比例并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同時(shí)通過共聚焦顯微鏡觀察和分析各組生物膜的形成狀況。
　　(2)基于Taqman探針的單細(xì)胞real-timeRT-PCR技術(shù)相對(duì)定量檢測(cè)滯留菌相關(guān)基因的表達(dá)水平
　　倒置顯微鏡下，使用自行拉制的分離微吸管吸取非滯留菌細(xì)胞和滯留菌細(xì)胞，進(jìn)行基于Ta

5、qman探針的單細(xì)胞real-timeRT-PCR，相對(duì)定量檢測(cè)白色念珠菌生物膜耐藥滯留菌EFG1、ERG2、MKC1、GIN4基因的表達(dá)水平，采用SPSS11.70軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　(1)對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和饑餓狀態(tài)白色念珠菌生物膜的形成能力依次下降(P＜0.05)，具有顯著性差異，對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期白色念珠菌生物膜形成的為菌絲相生物膜，而饑餓態(tài)白色念珠菌形成的為酵母相生物膜。藥物作用后滯留菌比例依次上

6、升(P＜0.05)。
　　(2)基于Taqman探針的單細(xì)胞real-timeRT-PCR技術(shù)相對(duì)定量地檢測(cè)出了白色念珠菌滯留菌中EFG1、ERG2、MKC1、GIN4的表達(dá)水平。其中，除了MKC1在滯留菌細(xì)胞和非滯留菌細(xì)胞中的表達(dá)水平無顯著性差異(P＞0.05)外，EFG1、ERG2、GIN4在滯留菌中的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05），具有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　(1)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)白色念珠菌滯留菌的產(chǎn)生有影響，

7、饑餓狀態(tài)能夠提高滯留菌的產(chǎn)生比例，提示白色念珠菌耐藥滯留菌形成與營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等環(huán)境因素有關(guān)。
　　(2)自制的分離微吸管能夠成功分離出滯留菌細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，基于Taqman探針的單細(xì)胞real-timeRT-PCR技術(shù)是快速檢測(cè)滯留菌相關(guān)基因表達(dá)水平的有效方法，為今后研究白色念珠菌滯留菌相關(guān)基因提供了方便、可行的研究技術(shù)。
　　(3)白色念珠菌滯留菌的形成與基因EFG1、ERG2以及GIN4均密切相關(guān)，并非由單一的信號(hào)通路決定