自噬對肝癌HepG2細胞和正常肝L-02細胞作用的差異及相關分子機制.pdf

1、背景：腫瘤在當今世界的全球死亡原因中位居第二位。原發(fā)性肝細胞癌（hepato-cellular carcinoma，HCC）惡性程度高，發(fā)展迅速，容易復發(fā)的特點，使大部分患者在就診時已經是晚期，失去了手術的最佳時機，而且肝癌對化療亦不敏感。故只有通過對于癌癥的發(fā)生及其發(fā)展機制的不斷深入研究，才能取得更有效的預防和治療方法。
　　在內質網腔內，由各種原因引起的蛋白質錯誤折疊及錯誤折疊的蛋白質的積累，被稱為內質網應激（endoplas

2、mic reticulum stress,ERS）。內質網應激刺激過強，除了可以導致細胞經凋亡途徑死亡外，還可以經II型程序性死亡方式－自噬。自噬是由基因調控并在進化上保守的介導的細胞自我消化的途徑，充當腫瘤發(fā)生的動態(tài)監(jiān)管機制。自噬對細胞的分化和發(fā)育起至關重要的作用，它是細胞對惡劣環(huán)境及壓力的一種反應，但其對細胞生存的意義并不清楚。
　　ERS的發(fā)生可導致細胞凋亡。BCL-2是從人類復發(fā)性濾泡性淋巴瘤染色體易位的斷點區(qū)被確定的凋亡

3、基因。Bcl-2家族蛋白不僅參與I型程序性細胞死亡（即凋亡），還參與了II型程序性死亡（即自噬）的調控。細胞自噬可防止抗腫瘤藥誘導的凋亡，促進腫瘤耐藥。然而，自噬性細胞死亡可能是凋亡耐受腫瘤細胞的一種死亡方式。本實驗主要探索在ERS狀態(tài)下，自噬對肝癌HepG2細胞及肝正常L-02細胞作用的差異，及通過對Bcl-2基因的研究，了解凋亡與自噬的關系，以期能夠為提高肝癌治療效果尋找新的策略。
　　第一部分觀察自噬抑制劑在內質網應激狀態(tài)下

4、對肝癌HepG2細胞和正常肝L-02細胞作用的差異
　　目的：觀察自噬在內質網應激（ERS）狀態(tài)下對肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L-02作用的差異。
　　方法：體外常規(guī)培養(yǎng)的人肝癌 HepG2細胞和正常肝 L-02細胞，分別給予衣霉素(TM)單藥和TM聯(lián)合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(TM+3-MA)或氯喹(TM+CQ)作用12、24、48 h后，采用MTT法檢測細胞活力變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blot

5、法檢測自噬蛋白LC3、抗凋亡蛋白Bcl-2的變化。
　　結果：TM可引起HepG2細胞和L-02細胞死亡并呈時間依賴關系，3-MA或CQ均可增加TM對HepG2細胞的生長抑制作用，24 h細胞存活率分別為TM+3-MA(60％)、TM+CQ(72%)、TM(86%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；但對于L-02細胞，其存活率分別為83%、84%、83%，活力沒有明顯差異；Annexin V/PI凋亡實驗顯示TM+3-MA、TM

6、+CQ和TM組對HepG2細胞的凋亡率分別為15%、11%和7%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但對L-02細胞組，凋亡率分別為16%、17%、16%，未見明顯差別；免疫印跡結果顯示 TM引起自噬增加，自噬抑制劑3-MA與CQ可引起兩種細胞自噬作用減弱；同時，在HepG2細胞中，加入自噬抑制劑后，Bcl-2基因表達下調，而在L-02細胞中，Bcl-2基因低表達且未見明顯變化。
　　結論：自噬抑制劑(或3-MA或CQ)均可顯著增

7、加TM對肝癌HepG2細胞的生長抑制，但對正常肝L-02細胞的生長抑制作用差異無統(tǒng)計學意義；在HepG2細胞中，加入自噬抑制劑后，Bcl-2基因表達下調，而在L-02中未見明顯差異。因此，可以認為自噬在 ERS狀態(tài)下可對癌細胞的生存提供保護，但對正常細胞無保護作用；同時，Bcl-2基因或是導致這一差異的分子機制之一。
　　第二部分初步探討B(tài)cl-2基因或是自噬對肝癌HepG2細胞提供生存保護的分子機制之一
　　目的：研究在E

8、RS狀態(tài)下，因Bcl-2基因在肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L-02中表達的差異，導致自噬可為肝癌HepG2細胞提供生存保護。
　　方法：體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞和正常肝L-02細胞，給以Bcl-2的siRNA敲除Bcl-2基因，設空白對照組，NC+TM組，siRNA+TM組，單藥TM組分別作用24h后，采用MTT法檢測細胞活力變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測抗調亡蛋白Bcl-2的變化。

9、>　　結果：轉染siRNA下調Bcl-2的基因后，MTT結果顯示：HepG2細胞中，siRNA+TM組細胞存活率為70%，較TM單藥組細胞存活率（88%）顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；L-02細胞組中siRNA+TM組細胞存活率為86%，與TM單藥組細胞存活率（81%）相比，差異無統(tǒng)計學意義。流式結果顯示：siRNA+TM組作用HepG2細胞24 h后，HepG2細胞凋亡率（11.17%）顯著高于TM組（7.78%），

10、差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；而 L-02組24 h，各實驗組間凋亡率（NC:19.60%、siRNA+TM:19.45%、TM:19.89%）未見明顯差異。Western blot法檢測顯示：HepG2細胞組中，轉染組Bcl-2/actin的灰度比值較TM單藥組顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；而L-02細胞組中，幾乎未見Bcl-2蛋白的表達。
　　結論：在TM誘導ERS狀態(tài)作用下，用siRNA下調Bcl-2