MicroRNA的檢測(cè)方法研究.pdf

1、microRNA（miRNAs）是一類長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性、非編碼小RNA，其廣泛存在于動(dòng)植物中。這些高度保守的miRNAs 通過(guò)結(jié)合mRNA的3’非翻譯區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miRNAs 促進(jìn)靶mRNA的降解和通過(guò)與靶mRNA形成復(fù)合二聚體抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯被認(rèn)為是最主要調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。但是目前仍需做更多的研究探索miRNAs 調(diào)節(jié)的精確機(jī)制。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 在動(dòng)植物細(xì)胞代謝和分化，DNA 損傷，細(xì)胞凋亡和腫

2、瘤發(fā)生等一系列細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。 最重要的是，現(xiàn)有的研究表明miRNAs 表達(dá)水平的改變與多種疾病相關(guān)，這意味著miRNAs 將有巨大的潛力成為診斷標(biāo)志物和癌癥治療的靶向。為了更深入地研究miRNAs的功能，需要一種能夠快速、靈敏、特異地檢測(cè)出miRNAs 在不同組織、不同器官、不同發(fā)育階段的表達(dá)狀況的檢測(cè)方法。 miRNAs 在不同物種和組織中表達(dá)水平差異很大，因此需要一種能準(zhǔn)確定量相應(yīng)組織器官中m

3、iRNAs的方法，同時(shí)miRNAs序列很短且序列同源，給發(fā)展超靈敏度的檢測(cè)方法帶來(lái)了挑戰(zhàn)。Northern blot 是國(guó)際上公認(rèn)的miRNAs 檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，在此基礎(chǔ)上建立了很多衍生方法，但是這類方法檢測(cè)前必須事先準(zhǔn)備大量的總RNA樣本，且檢測(cè)過(guò)程冗長(zhǎng)，技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)程度要求相對(duì)較高，所以限制了其應(yīng)用。最近介紹了多種不同的檢測(cè)方法，但是它們都要求高級(jí)的信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，在普通實(shí)驗(yàn)室不易開展，且其特異性水平不太穩(wěn)定。

4、 本研究建立了一種以核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別結(jié)合為基礎(chǔ)，經(jīng)銀染增強(qiáng)的納米金標(biāo)記探針的miRNAs 檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單易行，無(wú)需放射，熒光等昂貴設(shè)備就可獲得高靈敏度，高特異性的檢測(cè)信號(hào)，為miRNAs的研究開辟了新途徑。同時(shí)，研究設(shè)計(jì)了一種基于miRNAs 自引物擴(kuò)增的miRNAs 檢測(cè)方法，該方法新穎，快速，簡(jiǎn)單易行，檢測(cè)限達(dá)到100pg的組織總RNA，線形范圍廣達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)，因而該方法有望得到推廣應(yīng)用。 第一部分、應(yīng)用納米

5、金探針技術(shù)檢測(cè)MicroRNA 目的：本部分旨在建立一種基于銀染增強(qiáng)的納米金探針檢測(cè)miRNAs的方法。 方法：納米金顆粒標(biāo)記巰基修飾的寡核苷酸探針，納米金探針隨后與靶miRNAs 雜交，生物素標(biāo)記的捕獲探針再與靶miRNAs 雜交形成一個(gè)一端標(biāo)記納米金顆粒，一端標(biāo)記有生物素的雜交雙鏈。隨后轉(zhuǎn)移該雜交產(chǎn)物于鏈酶親和素包被的酶標(biāo)板中，經(jīng)孵育后，雜交產(chǎn)物通過(guò)鏈酶親和素－生物素特異識(shí)別系統(tǒng)固定在酶標(biāo)板上。1×PBS和2×PBN

6、溶液洗滌以去除酶標(biāo)板中游離的納米金探針，隨后銀染增強(qiáng)放大檢測(cè)信號(hào)，經(jīng)酶標(biāo)儀在630nm 波長(zhǎng)處對(duì)銀染增強(qiáng)液的OD 值進(jìn)行檢測(cè)，溶液OD 值變化的程度與納米金顆粒量的多少有關(guān)，而納米金顆粒的量取決于miRNAs的濃度。根據(jù)miRNAs的濃度和OD 值之間的關(guān)系，繪制出相應(yīng)的時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。 結(jié)果：在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，溶液的OD 值與miRNAs的濃度相關(guān)，在反應(yīng)過(guò)程中，miRNAs 濃度越高，溶液的OD 值變化程度越明顯

7、。而在無(wú)miRNAs的陰性對(duì)照中，溶液OD 值則無(wú)明顯的變化。通過(guò)對(duì)靶miRNAs 濃度和相應(yīng)的OD 值的分析，可以得出miRNAs的劑量－效應(yīng)關(guān)系曲線，在一定的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)和一定的濃度范圍內(nèi)（10pM～10fM），靶miRNAs的濃度與OD 值之間具有很好的線性關(guān)系（R2＝0.9906）。利用本方法能夠檢測(cè)到的合成miRNAs的最低濃度是10fM。且能夠在低致10fM 濃度水平，檢測(cè)出單核苷酸錯(cuò)配序列間的差異。 結(jié)論：納米金銀染

8、增強(qiáng)檢測(cè)miRNAs 技術(shù)是一種靈敏，特異，簡(jiǎn)單，快速，經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，有望能夠應(yīng)用于大多數(shù)生物樣本的檢測(cè)。 第二部分、自引物擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)microRNA 目的：本部分旨在建立一種基于miRNAs 作為自身引物從而擴(kuò)增放大信號(hào)的一種miRNAs 檢測(cè)方法。 方法：本方法利用長(zhǎng)約60個(gè)nt的合成模板寡核苷酸序列和工具酶（DNA 聚合酶與RNA 聚合酶）在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件條件下實(shí)現(xiàn)miRNAs的自引物擴(kuò)增（SPA）。該

9、模版寡核苷酸序列在3’端和5’端分別為兩個(gè)相同的與靶miRNAs的堿基互補(bǔ)的序列，在兩端序列中間則插入了一個(gè)啟動(dòng)子序列。靶miRNAs 互補(bǔ)結(jié)合模板寡核苷酸形成不完整雙鏈，然后Taq DNA 聚合酶以合成寡核苷酸為模板催化miRNAs 延伸形成完整雙鏈，隨后RNA 聚合酶在啟動(dòng)子下游轉(zhuǎn)錄出序列與靶miRNAs 一致的RNA序列，轉(zhuǎn)錄出的RNA序列又作為底物進(jìn)入下一次擴(kuò)增，如此反復(fù)循環(huán)，在等溫條件下實(shí)現(xiàn)miRNAs的擴(kuò)增，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中經(jīng)S

10、YBR Green 檢測(cè)出擴(kuò)增信號(hào)。 結(jié)果：SPA 方法的最低檢測(cè)限為1fM的合成miRNAs，從1fM 到1nM7個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)呈現(xiàn)了較寬的動(dòng)態(tài)范圍，靶miRNAs的濃度的對(duì)數(shù)值和CT 值間存在明顯的線形關(guān)系(R2=0.9849)，陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到明顯的信號(hào)。用于肝臟miR-122a的檢測(cè)時(shí)，最低檢測(cè)限是0.1ng的組織總RNA。 結(jié)論：雖然在通量方面尚有待改善提高，但是基于miRNAs 自引物擴(kuò)增的分子生物學(xué)檢測(cè)技