通用探針檢測方法的建立及其在布魯氏菌感染后宿主microRNA-155表達(dá)規(guī)律研究中的應(yīng)用.pdf

1、MicroRNA（簡稱 miRNA）是一類長約18-22個(gè)核苷酸的小分子 RNA，它們組成了機(jī)體內(nèi)的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以在多水平控制基因的表達(dá)。參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控，影響著動(dòng)物和植物的生長發(fā)育以及各種病理過程。要了解miRNA在機(jī)體生理、病理過程中的表達(dá)情況及其所發(fā)揮的重要作用，就需要有合適的方法對miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，從而才能夠開展更為深入的功能性研究。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）可以對目標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)精確定量，是

2、目前一種常用的miRNA檢測手段。本研究在qRT-PCR的基礎(chǔ)上，建立一種靈敏、特異的miRNA通用探針檢測方法，以達(dá)到僅利用一種檢測探針和下游引物實(shí)現(xiàn)對多條miRNA進(jìn)行檢測的目的。
　　布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病，對人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害。布魯氏菌具有多種毒力因子，通過逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用達(dá)到胞內(nèi)生存的目的，與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其中四

3、型分泌系統(tǒng)（T4SS）是一種重要毒力因子。布魯氏菌借助T4SS將相關(guān)效應(yīng)蛋白或毒素通過細(xì)胞膜分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)造成持續(xù)感染，而編碼T4SS的基因受virB操縱子編碼，所以virB對布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力具有十分重要的影響。敲除virB啟動(dòng)子毒力基因可以關(guān)閉T4SS，最終導(dǎo)致突變型存活率降低，不進(jìn)行持續(xù)感染，本實(shí)驗(yàn)即利用了實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的16M菌株virB基因缺失株。分別用布魯氏菌16M和16M△virB菌株感染小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264

4、.7、建立 BALB/c小鼠感染模型，觀察毒力引起的宿主microRNA-155（miR-155）表達(dá)水平變化。最終應(yīng)用通用探針檢測方法，對123例醫(yī)院臨床血清樣本miR-155表達(dá)水平進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。
　　miR-155是一種與免疫相關(guān)的小分子 RNA，在多種病原微生物感染后表達(dá)水平均發(fā)生變化，可以參與到病原微生物致病過程。本實(shí)驗(yàn)建立并應(yīng)用通用探針檢測方法，將該方法應(yīng)用于臨床樣本檢測，探討布魯氏菌感染后宿主 miR-155的表達(dá)

5、規(guī)律，挖掘miR-155作為診斷布魯氏菌病特征性標(biāo)識的可能性。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　一、通用檢測方法的建立
　　（1）逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)Uni-RT12、Uni-RT12A、Uni-RT12C、Uni-RT12G、Uni-RT12V、 Uni-RT12VN共6種逆轉(zhuǎn)錄引物，在人工合成的microRNA-146a(miR-146a)模擬物和臨床血漿樣本中比較各引物的差異。為二者的總RNA加Poly(A)尾，分別用以上6

6、種逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增6種逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 miR-146a，擴(kuò)增時(shí)使用設(shè)計(jì)的同一種通用探針和通用下游引物。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果判斷擴(kuò)增效果。利用高分辨溶解曲線（HRM）分析各逆轉(zhuǎn)錄引物特異性，最終篩選出特異性最強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄引物。結(jié)果顯示，在檢測實(shí)際樣本時(shí)，Uni-RT12A和Uni-RT12VN獲得了較好的效果。進(jìn)一步通過HRM分析，發(fā)現(xiàn)Uni-RT12A的溶解曲線峰值最高，沒有波肩，峰的跨度最小，特異性最好。
　　（2）反

7、應(yīng)體系優(yōu)化利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選定三因素四水平，具體如下：三個(gè)獨(dú)立因素即試劑盒種類、退火溫度和通用探針濃度，試劑盒種類包括 GoldStar TaqMan Mixture（Low ROX）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、2×EasyTaq PCR SuperMix和SuperReal PreMix（Probe）。退火溫度分別為62℃、60.7℃、58.4℃和55℃，通用探針濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.6μM

8、和0.8μM。在 miR-146a模擬物中進(jìn)行L16(4)3正交實(shí)驗(yàn)，共16次實(shí)驗(yàn)，通過直觀分析法比較各次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明，在使用2×GoldStar TaqMan Mixture、退火溫度為58.4℃、探針濃度為0.6μM時(shí)效果最佳。
　?。?）通用探針檢測方法評價(jià)通過與實(shí)驗(yàn)室較為常用的SYBR Green I染料法比較，對通用探針法的性能、通用性和擴(kuò)增范圍進(jìn)行評價(jià)。性能（特異性和靈敏性）比較：TRIzol法提取10例健康志愿

9、者血漿總RNA制成混合樣本，加Poly(A)尾后分別取不等量產(chǎn)物用于逆轉(zhuǎn)錄，分別用染料法和通用探針法進(jìn)行 qRT-PCR擴(kuò)增 miR-146a、miR-122、miR-155，比較兩種方法的差別。通用性評價(jià)：分別用這2種方法擴(kuò)增隨機(jī)挑選的8條miRNA，證明該方法對miRNA普遍適用。擴(kuò)增范圍分析：將已知濃度miR-146a模擬物逆轉(zhuǎn)錄后10倍梯度稀釋，分析該方法的擴(kuò)增范圍。結(jié)果表明，通用探針法特異性和靈敏性均高于染料法，擴(kuò)增范圍0.2

10、μM-0.2×10-4μM，在臨床樣本中可以檢測 miR-155、miR-146b、miR-223、miR-181c、miNA-27a、miR-29a、miR-29b-1、miR-146a共8條miRNA，具有較好通用性。
　　二、布魯氏菌病感染后宿主miR-155表達(dá)規(guī)律研究
　?。?）RAW264.7細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)用布魯氏菌16M和16M△virB菌株接種小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，陰性對照組接種PBS，在第0、24、和

11、48小時(shí)裂解細(xì)胞提取總RNA，分別檢測miR-155表達(dá)水平，采用相對定量（RQ）分析miR-155隨時(shí)間變化及組間差異。結(jié)果顯示，小鼠巨噬細(xì)胞在感染16M后的24小時(shí)，miR-155表達(dá)水平升高，在感染16M△virB后的0至48小時(shí)， miR-155表達(dá)水平降低。
　?。?）BALB/c小鼠感染實(shí)驗(yàn)分別用布魯氏菌16M和16M△virB菌株感染BALB/c小鼠，建立小鼠感染模型，以PBS作為陰性對照，在第7、14和28天提取小

12、鼠脾臟總RNA，分別檢測miR-155表達(dá)水平，采用相對定量分析miR-155隨時(shí)間變化及組間差異。結(jié)果顯示，小鼠內(nèi)源miR-155表達(dá)水平在感染16M后的7和14天被抑制，但是第28天升高，miR-155表達(dá)水平在感染16M△virB后的7天和14天與16M相反。在第7天時(shí)，感染16M△virB后的miR-155表達(dá)水平明顯高于16M。
　?。?）臨床樣本檢測收集布魯氏菌病患者、非布魯氏菌感染者和健康志愿者血清樣本，分別提取血清

13、總RNA，采用絕對定量（AQ）的方法檢測血清中miR-155表達(dá)水平，分析組間差異，統(tǒng)計(jì)樣本基本信息，分析血清miR-155的表達(dá)水平與抗體滴度和臨床癥狀之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，布魯氏菌病患者血清 miR-155表達(dá)水平與非布魯氏菌感染者和健康志愿者相比被顯著抑制，分析病例信息，血清miR-155表達(dá)水平與布魯氏菌抗體滴度和臨床癥狀（盜汗）明顯相關(guān)。
　　綜上所述，本研究建立了一種miRNA檢測新方法，與SYBR Green I染

14、料法相比特異性高、反應(yīng)靈敏，一次可檢測多條 miRNA，在進(jìn)行大量樣本檢測時(shí)具有較大優(yōu)勢。將該方法應(yīng)用于醫(yī)院臨床樣本miR-155的檢測中，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病患者與非布魯氏菌病感染者和健康志愿者相比，miR-155表達(dá)水平具有顯著性差異，布魯氏菌病患者血清miR-155與抗體滴度和臨床癥狀（盜汗）呈正相關(guān)，提示 miR-155可作為布魯氏菌病診斷的一個(gè)分子標(biāo)識。在早期感染中，布魯氏菌16M感染細(xì)胞和小鼠后，宿主 miR-155表達(dá)水平低于布