microRNA-24調控H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　大量研究表明，心肌缺血、缺血再灌注損傷、心臟重塑等心血管疾病的病理進程中可產生較多氧自由基，大量的氧自由基可引起心肌細胞氧化應激損傷，造成細胞器受損、DNA斷裂、細胞膜破損，最終導致心肌細胞壞死和凋亡，心肌細胞大量的壞死和凋亡又進一步加重疾病的嚴重程度，形成惡性循環(huán)。壞死常常發(fā)生在心肌缺血晚期，而凋亡則貫穿眾多心血管疾病的整個病程，因此減輕心肌細胞氧化應激損傷，減少心肌細胞凋亡對臨床心血管疾病的治療具有重要的意義

2、。
　　MicroRNAs(miRNAs)于1993年在線蟲體內首次被發(fā)現，是一類長度約為18-25nt的單鏈非編碼小分子RNA，其作為多靶點調控的上游調控因子，越來越受到人們的關注。目前已有多種miRNAs在動植物體內被發(fā)現，其通過抑制靶基因mRNA的翻譯過程，參與細胞增殖、分化與凋亡等的調節(jié);與個體發(fā)育、機體代謝以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。已有研究證明miRNAs能夠調控多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如miR-133a，miR

3、-26和miR-221調控心肌缺血引起的心臟重構、心衰、心肌纖維化等，但相關miRNA調控氧化應激損傷引起的心肌細胞凋亡的研究罕見報道。
　　本研究采用不同濃度H2O2處理H9c2心肌細胞，選擇最佳H2O2濃度建立心肌細胞凋亡模型，慢病毒轉染miR-24，探討miR-24對H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響及分子機制。
　　針對以上實驗設計，本課題擬進行如下研究:(1)體外培養(yǎng)H9c2心肌細胞，采用不同濃度H2O2處理

4、H9c2心肌細胞，MTT法檢測不同濃度H2O2對H9c2心肌細胞增殖活性的影響，計算抑制率，篩選最佳H2O2濃度，建立心肌細胞凋亡模型(2)采用慢病毒轉染方法上調H9c2心肌細胞中miR-24水平，探討miR-24對H2O2誘導的心肌細胞凋亡的影響。(3)檢測轉染miR-24后其靶基因E2F1的表達情況，探討miR-24對H2O2誘導的心肌細胞凋亡調控的分子機制。為揭示miR-24在H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡中的調控作用提供實驗

5、依據。
　　方法：
　　(1)不同濃度H2O2(25、50、100、200、400μmol/L)作用于H9c2心肌細胞，MTT法檢測細胞增殖活性，計算抑制率，選擇細胞增殖抑制率50％左右時的H2O2濃度建立心肌細胞凋亡模型。構建miR-24慢病毒及陰性對照載體，轉染H9c2心肌細胞，倒置熒光顯微鏡下估算轉染率，實時熒光定量PCR檢測miR-24及E2F1的表達水平，驗證轉染效果。
　　(2)將H9c2心肌細胞分為正常對

6、照組(NC組）、H2O2組、轉染慢病毒陰性對照+H2O2組（LV-GFP+H2O2組）、轉染miR-24+H2O2組(LV-miR-24-GFP+H2O2組)。
　　(3)FITC-AnnexinV/PI雙染流式細胞術檢測各組H9c2心肌細胞凋亡情況。
　　(4)采用2-ΔΔCT實時熒光定量PCR方法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)定量測定各組H9c2心肌細胞miR-24及E2F1mR

7、NA的表達水平。
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，定量資料用均數±標準差（(x)±s）表示，正態(tài)分布的兩組數據采用獨立樣本t檢驗，正態(tài)分布的兩組以上數據采用方差分析，非正態(tài)分布數據采用非參數檢驗，顯著水準α=0.05。
　　結果：
　　1.不同濃度H2O2對H9c2心肌細胞增殖活性的影響:
　　MTT法檢測不同濃度H2O2對細胞增殖活性的影響，細胞增殖抑制率(IR％)=1-處理組平均吸光度值/對照

8、組平均吸光度值。25、50、100、200、400μmol/LH2O2分別處理H9c2心肌細胞6h，結果顯示，隨著過氧化氫濃度的增加，對H9c2心肌細胞的抑制率越大，細胞凋亡的越多;過氧化氫的濃度為200μmol/L時，細胞增殖抑制率約為55％，因此采用200μmol/L的過氧化氫制作H9c2心肌細胞凋亡模型。
　　2.慢病毒表達載體的構建及轉染:
　　LV-miR-24-GFP及LV-GFP慢病毒表達載體的構建由上海吉凱基

9、因化學公司完成，獲得的慢病毒以1×109TU/mI共40μL即4×107TU的病毒數進行H9c2心肌細胞轉染。轉染72h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，細胞轉染效率均達80％以上，實時熒光定量PCR檢測轉染LV-miR-24-GFP、LV-GFP慢病毒的細胞及未轉染細胞miR-24的表達水平分別為（12.88±0.75vs3.16±1.01vs3.23±0.89），E2F1mRNA的表達水平分別為（4.11±0.77vs6.29±0.

10、98vs6.70±1.04），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），轉染成功。
　　3.各組H9c2心肌細胞凋亡水平比較:
　　(1)流式細胞術結果顯示，H2O2組與NC組比較細胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。
　　(2)LV-miR-24-GFP+H2O2組與LV-GFP+H2O2及H2O2組比較細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。
　　4.各組H9c2心肌細胞miR-24及E2F1mRNA表達水平比較:

11、>　　(1)H2O2組與NC組miR-24的表達量分別為(0.70±0.24vs3.23±0.89)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);E2F1mRNA的表達量分別為(11.12±1.81vs6.70±1.04)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2)LV-miR-24-GFP+H2O2組、LV-GFP+H2O組及H2O2組miR-24的表達量分別為（2.25±1.24vs0.72±0.12vs0.70±0.24），差

12、異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);E2F1的表達量分別為（8.30±1.04vs11.24±1.78vs11.12±1.81），差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　(1)H2O2可誘導H9c2心肌細胞凋亡。
　　(2)經H2O2處理的H9c2心肌細胞中，miR-24表達明顯減低，其靶基因E2F1表達升高。
　　(3)慢病毒轉染miR-24可抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡，此作用機制可能是