hTERT基因在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控研究.pdf

1、南昌大學(xué)博士學(xué)位論文hTERT基因在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控研究姓名：王聯(lián)群申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：劉德伍20100529中文摘要種細(xì)胞來延長細(xì)胞增殖壽命的成功嘗試，初步結(jié)果均表明顯著延長了細(xì)胞生命周期，并保持『F常表型且沒有惡性轉(zhuǎn)化傾向。皮膚發(fā)育生物學(xué)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在富含表皮干細(xì)胞的表皮基底層和生長期毛囊中均有端粒酶活性表達(dá)，提示端粒酶活性表達(dá)很可能與表皮干細(xì)胞增殖分化機制之問也存在著重要的內(nèi)在聯(lián)系。目前對體外培養(yǎng)的

2、人表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)特征及其與表皮干細(xì)胞增殖分化的關(guān)系仍缺乏了解?；诖?，本課題采用表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法，觀察hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)特征，探討其對體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用及意義；采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建的攜人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和增強型綠色熒光蛋白雙基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒plRES2EGFPhTERT轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞，觀察hTERTmRNA轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)、端粒酶活性

3、和細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，為其在皮肽組織工程中的應(yīng)用提供新思路和理論依據(jù)。第一部分人表皮干細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)目的：觀察體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞hTERT基因及其蛋白和端粒酶活性的表達(dá)特征，探討其對表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的作用及意義。方法：取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的妊娠24“26周齡胎兒背部皮膚標(biāo)本，由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供，均得到產(chǎn)婦或家屬知情同意，實驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸聯(lián)合消化法分

4、離表皮、Ⅳ型膠原快速粘附法純化人表皮干細(xì)胞，以含表皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基組成的人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察人表皮干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，計算其克隆形成率，測定細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行Dl整合素、’K19、p63和hTERT單抗檢測。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westemblot)分別檢測人表皮干細(xì)胞hTERTmRNA及其蛋白的表達(dá)，端粒重復(fù)序列擴增法(TRAP)ELISA檢測端