microRNA-200家族調(diào)控AP-2α基因表達的研究.pdf

1、AP-2α是轉(zhuǎn)錄因子AP-2家族的成員之一，通過調(diào)控細胞增殖和凋亡過程中的多種基因起到腫瘤抑制的作用。已有研究表明：包括順鉑在內(nèi)的多種化療藥物可誘導(dǎo)內(nèi)源性AP-2α的表達，從而促進癌細胞凋亡、增強細胞對化療藥物的敏感性。與此相反，microRNA-200(miR-200)家族(包括miR-200b、miR-200c和miR-429)在子宮內(nèi)膜癌與食道癌中高表達，而它們的過度表達與細胞對順鉑的抗性相關(guān)。因此，本文研究miR-200家族對A

2、P-2α基因的調(diào)控，以及與子宮內(nèi)膜癌細胞對順鉑敏感性的關(guān)系。
　　 我們通過生物信息學(xué)軟件Target Scan、Microcosm和miRanda來預(yù)測AP-2α基因上的miRNA結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)在AP-2α基因的3’端非翻譯區(qū)(UTR)有一個miR-200b、miR-200c和miR-429共有的miRNA應(yīng)答元件(MRE)，而且在這個應(yīng)答元件中具有一個單核苷酸多態(tài)性位點(SNP))rs1045385。為了驗證這個預(yù)測的MRE

3、是否正確，我們分別將AP-2α基因的野生型3’UTR、MRE缺失的3’UTR以及MRE克隆進雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO中，并且分別與miR-200b，miR-200c和miR-429共轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞中，轉(zhuǎn)染后24小時測定熒光素酶活性。結(jié)果表明：過表達miR-200b、miR-200c和miR-429都降低了MRE以及包含有MRE的野生型3’UTR的熒光素酶表達，而缺失了MRE的3’UTR的熒光素酶活性不受影響。這些結(jié)

4、果表明miR-200b，miR-200c和miR-429確實能結(jié)合到AP-2α基因3’UTR的MRE上。
　　 為了研究miR-200家族對內(nèi)源的AP-2α蛋白表達的影響，我們在AP-2α高表達的宮頸癌細胞系HeLa細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-200b，miR-200c和miR-429；在miR-200表達高的子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A細胞中轉(zhuǎn)染miR-200b，miR-200c和miR-429的抑制劑。轉(zhuǎn)染后36小時用Weste

5、rn blot檢測內(nèi)源AP-2α的表達。結(jié)果顯示在AP-2α高表達的宮頸癌細胞系HeLa中過表達miR-200b，miR-200c和miR-429中的任一個miRNA都能夠抑制內(nèi)源的AP-2α蛋白的表達，而在miR-200表達高的子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1-A細胞中抑制miR-200b，miR-200c和miR-429中的任一個miRNA的表達都能增強AP-2α的表達。這些結(jié)果說明miR-200b，miR-200c和miR-429都能負

6、調(diào)控細胞內(nèi)源性的AP-2α的表達。
　　 為了研究SNP rs1045385 A>C變化對miRNA結(jié)合的影響，我們將完整的3’UTR以及突變了SNP位點的3’UTR克隆進入pmirGLO中，并且與miRNA共轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞中，結(jié)果顯示當?shù)任晃稽cC替換為A后抑制了miR-200b，miR-200c和miR-429結(jié)合到3’UTR。為了進一步證明這個結(jié)論，我們構(gòu)建了兩種基因型的全長AP-2α(包含完整的編碼區(qū)和3’UTR

7、)表達質(zhì)粒pMyc-AP-2α(A)和pMyc-AP-2α(c)，然后將其分別與miR-200b，miR-200c和miR-429共轉(zhuǎn)染進HEK293細胞中。Western結(jié)果分析也表明AP-2α的3’UTR中rs1045385位點A改變?yōu)镃后，干擾了miR-200b，miR-200c和miR-429與AP-2α基因3’UTR的結(jié)合來，導(dǎo)致AP-2α的表達上調(diào)。
　　 我們接著測試了SNP rs1045385 A>C變化是否影響

8、子宮內(nèi)膜細胞對順鉑的敏感性。我們將兩種基因型的AP-2α表達質(zhì)粒pMyc-AP-2α(A)和pmyc-AP-2α(C)分別轉(zhuǎn)染進入HEC-1-A細胞中，并用不同濃度的順鉑處理6小時?？寺⌒纬蓪嶒灥冉Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pMyc-AP-2α(C)的HEC-1-A細胞對順鉑更加敏感，而轉(zhuǎn)染pMyc-AP-2α(A)的HEC-1-A細胞相對于對照組細胞則無太大影響。
　　 總之，我們發(fā)現(xiàn)miR-200b，miR-200c和miR-429在子宮