SARS冠狀病毒S2基因的克隆表達(dá)和S2蛋白抗原活性的初步研究.pdf

1、一、研究背景和目的 嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severacuterespiratorysyndrome，SARS)又稱傳染性非典型肺炎，是2003年新發(fā)現(xiàn)的一種呼吸系統(tǒng)傳染病，其病原體是SARS冠狀病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。 SARS-CoV屬于巢狀病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(coronavir)，為單正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約29.7kb，已知編碼11種蛋白，其中包括4種

2、結(jié)構(gòu)蛋白，分別是刺突蛋白(S)、包膜蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和核蛋白或核殼體蛋白(N)。S蛋白三聚體形成突起，伸出包膜表面。S蛋白是病毒的主要表面抗原成分，具有受體結(jié)合和膜融合活性，在組織嗜性、細(xì)胞融合和毒力等方面起重要作用。N蛋白與基因組RNA結(jié)合形成核衣殼。M蛋白和E蛋白是包膜形成所必需的成分。 S蛋白是Ⅰ型膜糖蛋白，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并與宿主細(xì)胞膜相融合。S蛋白由S1和S2兩個(gè)亞基組成。S1形成球狀部分，

3、S2形成棒狀部分，兩者之間通過(guò)分子間的作用力相互結(jié)合。S1能與宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合，S2可把整個(gè)S蛋白固定在細(xì)胞膜上，并介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合。S蛋白上有重要的病毒抗原決定簇，S基因的突變會(huì)影響病毒的致病性。 S蛋白由1256個(gè)氨基酸組成，有23個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，其N端和C端相對(duì)保守。N端有由疏水氨基酸組成信號(hào)肽，剪切點(diǎn)可能位于第13或14位氨基酸，可協(xié)助病毒固定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。C端由高保守的跨膜區(qū)域和富含半胱氨酸的區(qū)域組成

4、。S蛋白主要部分暴露于病毒的表面，這與其他冠狀病毒基本一致。通過(guò)對(duì)多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的SARS-CoV分離株S蛋白的編碼基因進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV的S蛋白比較保守，變異率低，其中S2比S1更為保守。在二級(jí)結(jié)構(gòu)上，S1區(qū)具有較多的β折疊，S2通常含有一些a螺旋兩性區(qū)。S蛋白C端的a兼性區(qū)(alpha-amphipathicregion)為卷曲結(jié)構(gòu)(coiled-coil)，能促進(jìn)部分肽段跨過(guò)細(xì)胞膜，促使病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合。

5、該兼性區(qū)約有2～3個(gè)，其中1個(gè)長(zhǎng)為116個(gè)氨基酸，位于S蛋白的884～999aa處。研究發(fā)現(xiàn)，在約729～770、879～1016和1164～1185處，分別有1個(gè)螺旋區(qū)域，可能為S2蛋白中的N/M/C螺旋處，該螺旋與病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合有關(guān)。 本項(xiàng)研究分析了在SARS流行期間不同時(shí)間、不同地點(diǎn)的11株SARS-CoV毒株S2基因的變異情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，S2基因變異速度逐漸減小。在SARS流行的晚期，S2基因

6、幾乎沒(méi)有變異。S2蛋白可能包含有1個(gè)內(nèi)在的融合肽和2個(gè)疏水的7次螺旋區(qū)域。7次螺旋區(qū)域在MHV等病毒的融合蛋白中均有發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，兩段疏水的7次螺旋區(qū)域具有吸附與穿入活性。另有研究者預(yù)測(cè)，S2蛋白的M螺旋(884～999aa)能促進(jìn)部分肽段跨過(guò)細(xì)胞膜，促使病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，S2蛋白的M螺旋處為S2蛋白中2個(gè)7次螺旋區(qū)域中的一段。因此，本研究將靶蛋白鎖定為S2和S2M蛋白(S2蛋白M螺旋471～884位核苷酸

7、)?？寺～@得SARS冠狀病毒S2、S2M基因，在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白加以純化，初步研究其抗原活性。 二、研究方法 1、根據(jù)GenBank提供的SARS-CoVBJ01株基因組序列(AY288478)，設(shè)計(jì)引物，以本實(shí)驗(yàn)室分離的GD322株基因組為模板，擴(kuò)增S1、S2基因，構(gòu)建克隆載體pGEM-T-S1、pGEM-T-S2，通過(guò)PCR鑒定。 2、從GenBank下載有代表性的11株SARS

8、-CoV序列，分別輸入LaserGene軟件包的Editseq軟件中，截取S2基因片段，并翻譯成氨基酸序列。利用ClustalX軟件，將擴(kuò)增的S2基因與下載的11株S2基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較，并通過(guò)TreeView軟件制作系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DNAMAN軟件對(duì)S2基因進(jìn)行抗原表位的預(yù)測(cè)，利用Internet數(shù)據(jù)庫(kù)分析S2基因T細(xì)胞抗原表位。 3、根據(jù)GD322株S2和S2M基因序列設(shè)計(jì)引物，在引物兩端分別加上EcoRI或Xh

9、oI酶切位點(diǎn)，以pGEM-T-S2質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增S2和S2M段，連接至pGEM-T載體，得到pGEM-T-S2和pGEM-T-S2M重組克隆載體。 4、將pGEX-4T-1與pGEM-T-S2和pGEM-T-S2M分別經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切后連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-1-S2和pGEX-4T-1-S2M，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，通過(guò)雙酶切及PCR鑒定后測(cè)序。 5、利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS-PA

10、GE電泳及Western-Blot鑒定表達(dá)蛋白。 6、優(yōu)化表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的可溶性表達(dá)，通過(guò)GST親和層析柱純化S2和S2M蛋白。 7、利用間接ELISA法，將表達(dá)蛋白與SARS陽(yáng)性病人血清進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)表達(dá)蛋白的活性。 8、利用間接ELISA法將表達(dá)蛋白與從醫(yī)院隨機(jī)收集的非SARS病人血清及普通冠狀病毒OC43、229E免疫兔血清進(jìn)行反應(yīng)，分析純化蛋白是否與普通冠狀病毒OC43、229E有共同抗原成分，分

11、析S2和S2M蛋白的特異性。 9、將VeroE6、BHK-21細(xì)胞分別裂解，與純化蛋白進(jìn)行ELISA反應(yīng)，了解細(xì)胞表面是否存在可以識(shí)別S2蛋白的受體。 三、研究結(jié)果 1、RT-PCR擴(kuò)增及克隆SARS-CoVGD322株S1、S2基因，S1基因全長(zhǎng)2163bp，S2基因全長(zhǎng)1605bp，與SARS-CoVBJ01株S1基因同源性為99.88％，與S2基因同源性為99.92％。結(jié)果已登錄GenBank，S2基因登錄

12、號(hào)為AY707461，S1基因登錄號(hào)為DQ407820。以S2基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增并克隆S2M基因。 2、使用ClustalX軟件對(duì)12株不同時(shí)期、不同地區(qū)分離的SARS-CoVS2基因進(jìn)行比對(duì)分析，并使用TreeView軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn)早期分離株之間存在的差異大于0.3％，中期分離株之間的差異小于0.1％，晚期分離株同部分中期分離株之間的差異小于0.1％。 3、通過(guò)Internet網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)12株SARS-Co

13、VS2蛋白氨基酸序列進(jìn)行T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)只存在一處T細(xì)胞抗原表位的改變。早期分離株的第57位氨基酸為D，其余各株均為Y，該氨基酸的改變可引起T細(xì)胞抗原表位的改變。 4、通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，pGEX-4T-1-S2和pGEX-4T-1-S2M可在大腸桿菌中高效表達(dá)融合蛋白，分子量分別是85KDa和41KDa。表達(dá)融合蛋白以可溶性蛋白的形式分泌在細(xì)胞質(zhì)中。融合蛋白含有GST標(biāo)簽，有利于純化。 5、通過(guò)GST親和層析純化

14、后，得到具有生物活性的目的蛋白。 6、純化蛋白S2可與SARS陽(yáng)性病人血清反應(yīng)，也可同普通冠狀病毒229E免疫兔血清發(fā)生交叉反應(yīng)，但不與正常人血清反應(yīng)，也不與普通冠狀病毒OC43免疫兔血清反應(yīng)。純化蛋白S2M可與SARS陽(yáng)性病人血清反應(yīng)，但不與正常人血清反應(yīng)，也不與普通冠狀病毒OC43、229E免疫兔血清反應(yīng)。 7、純化蛋白S2可與VeroE6細(xì)胞裂解產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也可與BHK-21細(xì)胞裂解產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。但S2M不與上述

15、細(xì)胞裂解產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)。 四、結(jié)論 1、生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，隨著SARS的流行，S2基因變異存在一定的規(guī)律。 2、成功構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-S2和pGEX-4T-1-S2M，經(jīng)誘導(dǎo)后，可以在上清中表達(dá)融合蛋白，分子量分別為85KDa和41KDa。 3、S2和S2M融合蛋白具有良好的抗原活性。S2蛋白與229E病毒顆粒存在共同抗原成分，而S2M蛋白與OC43和229E病毒顆粒不存在共同抗