Rab6蛋白在果蠅S2細(xì)胞抗病毒吞噬中的作用.pdf

1、Rab GTPase蛋白是小分子GTP結(jié)合蛋白(small GTP-binding proteins)中最大的亞家族，它調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞器之間的膜通訊。Rab蛋白作為囊泡運(yùn)輸?shù)姆肿娱_(kāi)關(guān)，與其上游調(diào)控因子和下游特定的效應(yīng)子相互作用，在囊泡的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定、融合等過(guò)程中起重要作用。然而，Rab GTPase蛋白在免疫系統(tǒng)中的作用有待于深入研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，Rab蛋白超家族成員Rab6參與對(duì)蝦抗病毒免疫的一條可

2、能途徑是，通過(guò)與β-actin的互作，調(diào)控對(duì)蝦血細(xì)胞的吞噬活性。因?yàn)槿毡緦?duì)蝦和模式生物果蠅同屬于節(jié)肢動(dòng)物門，且它們的Rab6蛋白同源性達(dá)到90.47％，所以可以使用果蠅S2細(xì)胞模擬蝦血細(xì)胞的吞噬過(guò)程，來(lái)研究其對(duì)果蠅C病毒(DCV)的吞噬過(guò)程，進(jìn)而獲得對(duì)于Rab6蛋白在無(wú)脊椎動(dòng)物抗病毒細(xì)胞吞噬中作用的認(rèn)識(shí)。
　　 為了了解Rab6蛋白在果蠅細(xì)胞吞噬中的作用，我們采用具有吞噬能力的果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。首先，我們需要證明S2細(xì)胞中R

3、ab6蛋白能夠表達(dá)，所以我們制備Rab6的特異性抗體，再進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果表明Rab6蛋白在S2細(xì)胞中能夠正常表達(dá)。根據(jù)本試驗(yàn)室對(duì)蝦研究結(jié)果，Rab6蛋白通過(guò)與β-actin蛋白互作調(diào)控吞噬，因此本研究構(gòu)建Rab6與actin的重組表達(dá)質(zhì)粒，并將這2種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞，隨后進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，結(jié)果顯示在S2細(xì)胞中Rab6蛋白與actin蛋白存在相互作用。這表明Rab6蛋白可能通過(guò)與actin蛋白互作參與細(xì)胞吞噬。<

4、br>　　 為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Rab6蛋白對(duì)細(xì)胞吞噬中的調(diào)控作用，一方面，我們?cè)诠塖2細(xì)胞中采用RNA干擾技術(shù)敲低Rab6基因的表達(dá)，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)Rab6基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)果表明，Rab6特異的siRNA作用后，Rab6 mRNA和Rab6蛋白表的達(dá)水平大幅度降低；此時(shí)使用滅活的FITC標(biāo)記的DCV病毒進(jìn)行吞噬活性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在Rab6蛋白表達(dá)被抑制的條件下，細(xì)胞的吞噬活性大幅度降低。另一方面

5、，我們使用轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒的方法使Rab6基因上調(diào)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab6蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著升高，DCV病毒的吞噬試驗(yàn)表明S2細(xì)胞的吞噬活性隨著Rab6蛋白的表達(dá)水平升高而上升。在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究采用共轉(zhuǎn)染Rab6特異的siRNA(抑制S2內(nèi)源Rab6的表達(dá))和合同義突變Rab6基因的表達(dá)質(zhì)粒(缺乏Rab6-siRNA的作用位點(diǎn)，產(chǎn)生外源Rab6蛋白)到S2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab6的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均恢復(fù)到正常水平，此時(shí)S2細(xì)胞

6、的吞噬活性也恢復(fù)到正常水平。以上結(jié)果說(shuō)明Rab6蛋白確實(shí)能夠調(diào)控S2細(xì)胞的吞噬活性。
　　 為了研究Rab6蛋白調(diào)控細(xì)胞吞噬后的抗病毒作用，本研究對(duì)具有感染能力的DCV病毒對(duì)S2細(xì)胞感染后的感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在Rab6蛋白的表達(dá)被抑制時(shí)，被病毒感染的S2細(xì)胞內(nèi)的DCV濃度較未被抑制的對(duì)照組上升；當(dāng)Rab6表達(dá)上調(diào)時(shí)，DCV的濃度較對(duì)照組下降；而干擾內(nèi)源Rab6表達(dá)然后導(dǎo)入外源的Rab6后，細(xì)胞內(nèi)的DCV濃度較

7、對(duì)照組降低。以上結(jié)果證明Rab6蛋白具有調(diào)控細(xì)胞抗病毒吞噬的功能。
　　 為了觀察Rab6蛋白參與S2細(xì)胞吞噬病毒的整個(gè)過(guò)程，我們使用熒光染料標(biāo)記Rab6-actin蛋白復(fù)合體，并使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。結(jié)果表明，在從吞噬開(kāi)始發(fā)生到病毒被吞入細(xì)胞內(nèi)的整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞吞噬病毒的部位，Rab6蛋白的表達(dá)量顯著上升，證明Rab6蛋白確實(shí)能夠參與細(xì)胞的抗病毒吞噬，發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述，Rab蛋白超家族成員Rab6