低氧激活Notch通路抑制間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的:骨缺損修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)以其生物學(xué)特性吸引了諸多學(xué)者的目光。氧作為生命活動(dòng)所必需的環(huán)境因素，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用，同樣，氧的存在也是MSCs的存活、增殖和分化過程中不可缺少的條件之一。骨髓中的氧大約是1％-7％ pO2，這比一般環(huán)境中的20％低很多。在病理?xiàng)l件下如骨缺損的修復(fù)過程中，MSCs需保持在更低的氧的環(huán)境中發(fā)揮它應(yīng)有的作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究低氧對(duì)MSCs成

2、骨分化的影響;在MSCs的成骨分化過程中低氧與Notch信號(hào)之間的關(guān)系以及低氧條件下Notch信號(hào)對(duì)MSCs成骨分化影響的機(jī)制。
　　方法:在1％ pO2（低氧）或21％ pO2（正常氧）氧下培養(yǎng)MSCs，對(duì)目的細(xì)胞分別進(jìn)行ALP活性分析，實(shí)時(shí)PCR指定基因表達(dá)分析，ARS著色礦化檢測(cè);在MSCs分化過程中通過實(shí)時(shí)PCR在7天、14天、21天的時(shí)候檢測(cè)Notch1的表達(dá)水平，通過免疫印跡檢測(cè)Notch1的蛋白表達(dá)水平;Notch1

3、專一性的慢性病毒調(diào)節(jié)shRNA注入MSCs以抑制Notch信號(hào)活性;在成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7天以后，觀測(cè)ALP活性、Runx2、OPN和OCN的mRNA表達(dá)水平及成骨礦化水平;在低氧和正常氧條件下測(cè)量Runx2在對(duì)照Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中和Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中蛋白表達(dá)水平;免疫沉淀實(shí)驗(yàn)研究Notch1和Runx2的關(guān)系;使用骨鈣素和纖連蛋白啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果:體外

4、培養(yǎng)后細(xì)胞的ALP活性在低氧條件下比正常氧條件下低很多;實(shí)驗(yàn)組低氧組中三種基因的表達(dá)水平比正常氧條件下低很多;相應(yīng)的，在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上，低氧條件下培養(yǎng)的MSCs分化的礦化水平相比正常氧條件下顯著降低。實(shí)時(shí)PCR在7天、14天、21天的時(shí)候檢測(cè)Notch1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)與正常氧相比，Notch1的表達(dá)在低氧條件下顯著升高。和mRNA水平一致，Notch1在低氧條件下培養(yǎng)的MSCs7天、14天、21天各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中的蛋白表達(dá)水平顯著增加。Not

5、ch1專一性的慢性病毒調(diào)節(jié)shRNA被注入MSCs來抑制Notch信號(hào)活性。Notch1的表達(dá)被shRNA明顯抑制。當(dāng)Notch1 shRNA和控制shRNA轉(zhuǎn)化的MSCs在成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7天以后，在對(duì)照組細(xì)胞中，ALP活性在低氧條件下比在正常氧條件下低很多;在Notch1抑制的細(xì)胞中，ALP活性差異在兩種條件下不明顯。除此之外，Runx2，OPN和OCN的mRNA表達(dá)水平在控制shRNA轉(zhuǎn)化組中低氧和正常氧下差別很大，但在Notc

6、h1 shRNA轉(zhuǎn)化組中就不明顯。相同的，礦化水平差異在shRNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不明顯，但是在對(duì)照組中就很明顯。我們進(jìn)一步研究了低氧通過Notch信號(hào)抑制MSCs成骨分化的機(jī)制?；赗unx2對(duì)于成骨細(xì)胞分化是很關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在低氧和正常氧條件下測(cè)量Runx2在對(duì)照Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中和Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中蛋白表達(dá)水平。不管是在低氧還是正常氧條件下，Notch1抑制都可導(dǎo)致Runx2的上調(diào)。另外，免疫沉

7、淀實(shí)驗(yàn)顯示Notch1可以綁定在Runx2上。為了進(jìn)一步研究Notch1和Runx2之間綁定的功能性結(jié)果，在對(duì)照組和Notch1 shRNA轉(zhuǎn)染組中Runx2的轉(zhuǎn)錄活性通過使用骨鈣素和纖連蛋白啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定。Runx2的轉(zhuǎn)錄活性在Notch1抑制后顯著提高。
　　結(jié)論:低氧抑制MSCs成骨分化;在MSCs的成骨分化過程中低氧可激活Notch信號(hào);Notch信號(hào)對(duì)于MSCs成骨分化的低氧性損傷是必須的;Notch通過直接綁定