弓形蟲重組蛋白質(zhì)疫苗和DNA疫苗的實驗研究.pdf

1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，能感染包括人體在內(nèi)的所有溫血動物，引起人獸共患弓形蟲病，嚴(yán)重威脅著人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)，己引起醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)界的高度重視。 弓形蟲在世界范圍內(nèi)廣泛分布與流行，估計全球近半數(shù)的人群感染了弓形蟲。許多國家的弓形蟲人群感染率在25％～50％左右，歐洲一些發(fā)達(dá)國家高達(dá)80％以上。我國的弓形蟲人群感染率相對較低，約為5％～10％左右。除了感染人，弓形蟲還可以感染家畜、家

2、禽，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。寵物貓、狗等容易感染弓形蟲，成為人類感染弓形蟲的重要傳染源，嚴(yán)重威脅著寵物主人的健康，尤其是孕婦和胎兒的健康。近年來，由于飼養(yǎng)業(yè)、畜禽肉加工業(yè)的迅速發(fā)展和寵物愛好者以及食用未充分煮熟肉類、禽蛋者的增多，人群的弓形蟲感染率呈上升趨勢。因此，弓形蟲感染仍然是世界性公共衛(wèi)生問題。 由于弓形蟲是一種機(jī)會性致病原蟲，故免疫功能正常的成年人感染弓形蟲多表現(xiàn)為隱性感染。但是當(dāng)感染者機(jī)體免疫功能受累時，如患A

3、IDS、惡性腫瘤或進(jìn)行器官移植及其長期服用免疫抑制劑等，體內(nèi)寄生的弓形蟲就會大量增殖，其致病力也明顯增強(qiáng)，可導(dǎo)致機(jī)體廣泛的病理損害，引起弓形蟲腦炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎或腹膜炎等臨床癥狀，成為病人致死的主要原因之一。 如果女性在懷孕期間首次感染弓形蟲，蟲體隨血流通過胎盤屏障傳給胎兒，或者因胎兒攝入羊水而感染，常導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎，即使胎兒順利娩出，也往往伴有弓形蟲性腦炎、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、智力發(fā)育障礙或畸形等嚴(yán)重后遺癥，嚴(yán)重影響優(yōu)生

4、優(yōu)育、人口素質(zhì)和社會發(fā)展。所以，弓形蟲感染被列為致畸宮內(nèi)感染TORCH綜合征的首位病因。 如果懷孕的動物感染弓形蟲后，同樣可造成流產(chǎn)、死產(chǎn)，其中豬、山羊、綿羊、牛在懷孕時初次感染弓形蟲是其流產(chǎn)的主要原因之一，由此造成畜牧業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。 目前，還沒有理想的藥物用于弓形蟲病的治療。鑒于既往應(yīng)用疫苗防治多種疾病的經(jīng)驗以及宿主感染弓形蟲后可獲得一定的抗蟲重復(fù)感染免疫，研制安全有效的弓形蟲疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對弓形蟲感染的保護(hù)性

5、免疫應(yīng)答，是防治弓形蟲病的理想措施和發(fā)展方向。 弓形蟲疫苗研究不僅必要而且意義重大，因為人類迫切需要弓形蟲疫苗，以保障人類健康，提高出生人口質(zhì)量，節(jié)約衛(wèi)生資源；同樣，養(yǎng)殖業(yè)需要弓形蟲疫苗，中國肉食豬養(yǎng)殖業(yè)占世界范圍的50％以上，而且馬、牛、羊、雞、兔等也容易感染弓形蟲，直接影響著人類健康；寵物豢養(yǎng)也需要弓形蟲疫苗，寵物傳播弓形蟲威脅著寵物主人的健康，尤其是孕婦和胎兒的健康。 國內(nèi)外學(xué)者對弓形蟲疫苗研究進(jìn)行不懈的努力和探索

6、，疫苗研究經(jīng)歷了全蟲疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗等發(fā)展階段。 由致死的全蟲或全蟲裂解物制成的弓形蟲死疫苗，比較安全，但免疫原性較低，即使嘗試不同免疫途徑或添加佐劑，也不足以產(chǎn)生保護(hù)性免疫。所以，死疫苗對人群和家畜無多大實用價值。弓形蟲減毒活疫苗的接種過程與自然的亞臨床感染相似，能全方位調(diào)動機(jī)體的免疫應(yīng)答，如ts-4溫度敏感株、RH株、T-263突變株等均對動物有免疫保護(hù)作用，但此類疫苗存在經(jīng)回復(fù)突變成為強(qiáng)毒株的可能，故不適用于

7、人類。 基因工程亞單位疫苗比傳統(tǒng)疫苗安全有效，可以大規(guī)模生產(chǎn)，避免了蟲體來源的困難，也容易被管理部門和公眾所接受，是弓形蟲疫苗發(fā)展方向之一。目前亞單位疫苗研究大多集中在弓形蟲SAG1(P30)抗原上。SAG1僅出現(xiàn)在弓形蟲速殖子期，具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫保護(hù)性，可夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA等高效價的抗體以及細(xì)胞因子IFN-γ等。先后有研究者用純化SAG1、重組SAG1或截取SAG1肽段免疫動物，實驗結(jié)果均表明SAG1

8、具有抗弓形蟲感染作用，是最有希望的弓形蟲疫苗候選抗原。 近年來，學(xué)者們還對在其它蟲期表達(dá)的致密顆?？乖?GRA)、棒狀體蛋白(ROP)等進(jìn)行了研究。 致密顆粒蛋白(GRA)是弓形蟲致密顆粒細(xì)胞器分泌的一種具有免疫活性的蛋白質(zhì)，是構(gòu)成弓形蟲速殖子納蟲泡和緩殖子囊壁的主要成分，它在修飾調(diào)理納蟲泡中起重要作用，并關(guān)聯(lián)于泡內(nèi)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，參與蟲體在細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制。其中GRA2在整個弓形蟲生活史周期具有較強(qiáng)的免疫原性，用純化的GR

9、A2免疫小鼠可誘導(dǎo)對慢性弓形蟲感染的體液免疫和細(xì)胞免疫。GRA2作為弓形蟲疫苗候選抗原具有潛力。 由于弓形蟲生活史非常復(fù)雜，形態(tài)多變，寄生宿主廣泛，從而造成其不同性質(zhì)抗原的免疫性各不相同，而且蟲期特異性抗原產(chǎn)生僅對該蟲期的免疫作用，單一抗原分子不能誘導(dǎo)機(jī)體對弓形蟲產(chǎn)生足夠的保護(hù)性免疫。所以發(fā)展多種抗原組合、針對不同蟲期的弓形蟲復(fù)合疫苗或多價疫苗具有解決上述問題的潛力。 蛋白質(zhì)成功表達(dá)的關(guān)鍵是選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。原核細(xì)胞表

10、達(dá)系統(tǒng)是最為成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，操作簡單，可以大量生產(chǎn)目的蛋白，但是缺乏真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，表達(dá)產(chǎn)物不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結(jié)構(gòu)和特定生物功能的蛋白質(zhì)，常以包涵體形式存在，經(jīng)過變性復(fù)性后，表達(dá)產(chǎn)物又容易失去免疫活性。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然具備完整的蛋白質(zhì)組裝和修飾系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)象也接近天然蛋白質(zhì)，但是蛋白表達(dá)量低，純化困難，培養(yǎng)成本高，對環(huán)境和操作要求也高，從而會影響蛋白質(zhì)的下游研究和大規(guī)模

11、的動物實驗。 為此，本研究擬分別構(gòu)建含弓形蟲靶抗原SAG1和GRA2的重組蛋白質(zhì)疫苗和DNA疫苗，輔以合適的佐劑，優(yōu)化免疫策略，選擇合適途徑免疫BALB/c小鼠，檢測疫苗誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，最后進(jìn)行免疫鼠抗攻擊感染實驗，觀察小鼠生存時間，評價疫苗和佐劑的免疫保護(hù)效果，探討疫苗和佐劑的作用性質(zhì)與機(jī)理，為研制安全有效的弓形蟲疫苗提供理論和實驗依據(jù)。 一、弓形蟲重組蛋白SAG1-GRA2疫苗的構(gòu)建及其免疫學(xué)研究

12、從弓形蟲RH株基因組：DNA中擴(kuò)增編碼弓形蟲主要表面抗原SAG1和致密顆蛋白GRA2基因片段，構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pGAPZαA-SAG1-GRA2，PCR、酶切及測序鑒定；線性化重組酵母表達(dá)載體，采用電穿孔法將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115感受態(tài)，抗生素Zeocin篩選、PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，對酵母工程菌進(jìn)行搖瓶表達(dá)，采用親和層析法分離純化重組蛋白SAG1-GRA2，并進(jìn)行SDS.PAGE和Western blotting分析鑒定；用純化的

13、重組蛋白SAG1-GRA2免疫BALB/c小鼠，測定小鼠血清抗弓形蟲特異抗體IgG及IgG亞型，ELISA法測定小鼠IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子水平，用弓形蟲速殖子攻擊感染小鼠，觀察小鼠生存時間。 研究結(jié)果表明，重組酵母表達(dá)載體pGAP-SAG1-GRA2成功構(gòu)建，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定正確；重組蛋白SAGl-GRA2在畢赤酵母中分泌表達(dá)，經(jīng)Westernblotting鑒定具有免疫原活性。重組蛋白SAG1-GRA2免疫小鼠可

14、誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體IgG，并且誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。盡管所有接受弓形蟲RH株速殖子攻擊的小鼠均未能存活，但重組蛋白SAG1-GRA2免疫組小鼠感染后生存時間與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 研究結(jié)果初步表明，以重組蛋白SAG1-GRA2作為弓形蟲蛋白質(zhì)疫苗，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以抗弓形蟲特異性抗體為主的體液免疫，也可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Thl型細(xì)胞免疫，具有一定的抗弓形蟲感染保護(hù)

15、作用。 二、弓形蟲重組DNA疫苗與SPreS2基因佐劑的構(gòu)建及其免疫學(xué)研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲SAG1和GRA2基因片段，分別構(gòu)建重組表達(dá)載體pVAX1-GRA2、pVAX1-SAGl和pVAX1-SAG1-GRA2，進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定；利用重疊延伸PCR技術(shù)將HBsAg的S和PreS2基因在體外進(jìn)行重疊拼接后，構(gòu)建pVAX1-SPreS2重組載體DNA，進(jìn)行PCR、雙酶切和測序鑒定；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞

16、(HFF)，建立體外真核細(xì)胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)，RT-PCR法對mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)果進(jìn)行驗證，SDS-PAGE和Wester boltting法檢測表達(dá)產(chǎn)物；將弓形蟲DNA疫苗pVAX1-GRA2、pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG1-GRA2或輔以基因佐劑pVAX1-SPreS2經(jīng)肌肉注射BALB/c小鼠，測定小鼠血清抗弓形蟲特異IgG抗體及其亞型，小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-10水平，測定NK細(xì)胞殺傷活性和淋巴細(xì)胞增殖能力

17、，最后用弓形蟲RH株速殖子攻擊感染小鼠，觀察小鼠生存時間。 研究結(jié)果顯示，弓形蟲重組DNA疫苗pVAX1-GRA2、pVAX1-SAG1和pVAX1-SAG1-GRA2以及基因佐劑pVAX1-SPreS2成功構(gòu)建，分別在HFF細(xì)胞中瞬時表達(dá)目的蛋白，經(jīng)RT-PCR鑒定mRNA正確轉(zhuǎn)錄，Wester boltting鑒定表達(dá)產(chǎn)物具有免疫活性。小鼠接種弓形蟲重組DNA疫苗能夠模擬弓形蟲的自然感染，不僅可誘導(dǎo)小鼠體液免疫，還可誘導(dǎo)細(xì)胞