細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗構(gòu)建及其免疫機制研究.pdf

1、目的：制作細粒棘球蚴BALB/e鼠模型，從細粒棘球絳蟲原頭節(jié)擴增Eg95蛋白編碼基因，克隆入大腸桿菌．分枝桿菌穿梭載體pBCG，電穿孔轉(zhuǎn)化BCG，構(gòu)建細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗，探討Eg95抗原在重組BCG中的表達效率；用該疫苗免疫BALB/c小鼠，動態(tài)觀察免疫小鼠血清IgE、IgG及其亞類的變化規(guī)律；脾T細胞CD4+和CD8+亞群變化，以及脾細胞培養(yǎng)上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α變化水平；通過不同的免疫途徑

2、接種疫苗，在原頭節(jié)攻擊后，觀察實驗動物產(chǎn)生的保護力和檢測血清IgE、IgG及其亞類；脾T細胞CD4+和CD8+亞群變化，脾細胞培養(yǎng)上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平，以及脾細胞的凋亡，從而初步闡述其保護性免疫機制，為CE疫苗的開發(fā)利用提供依據(jù)。 方法：以BALB/e鼠作為宿主，用腹腔注射Eg原頭節(jié)的方法制作細粒棘球蚴BALB/e模型。從Eg包囊中分離原頭節(jié)，超聲粉碎后抽提總RNA作為模板。根據(jù)Genbank(A

3、F199354)基因序列，自行設(shè)計一對引物并加入內(nèi)切酶位點，采用RT-PCR方法擴增Eg95編碼基因并鑒定，將該基因片段定向克隆入大腸桿菌-分枝桿菌表達載體pBCGHsp70啟動子下游，構(gòu)建pBCG-Eg95重組質(zhì)粒。用電穿孔法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BCG菌構(gòu)建rBCG-Eg95疫苗，用HgCl2篩選經(jīng)PCR鑒定。用熱誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)rBCG-Eg95疫苗進行表達，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定表達的重組蛋白。 將BALB

4、/c小鼠隨機分為兩組：鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組，分別用5×107CFU/mllOul和4×108CFU/ml1m1重組BCG-Eg95疫苗接種。于免疫后O、2、4、6、8、10、12、14、16和18w分別剖殺4只小鼠，收集血清，研究疫苗免疫后不同時間血清IgE、IgG及其亞類的變化規(guī)律。疫苗免疫后O、2、4、6、8、10、12、14、16和18w分別剖殺4只小鼠，分離脾細胞，應(yīng)用FACSort流式細胞儀檢測T細胞CD4+和CD8

5、+亞群百分比變化。用棘球蚴囊液抗原、刀豆蛋白A或PHA刺激脾細胞培養(yǎng)后，檢測其上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α變化水平。 將84只BALB/c小鼠分為7組，A組為皮下注射組，接種5×107CFU100μL；B組為鼻腔粘膜組，接種5×107CFU10μL；C組為口服灌胃組，接種4×108CFUlmL；D組為肌肉注射組，接種5×107CFUl00μL；E組為pIL-12肌肉注射組，接種50μg／mLpIL-12100

6、uL，在注射pIL-12質(zhì)粒前24h，在后腿股四頭肌注射0．5％的鹽酸布比卡因50μL，然后在同一點注射pIL-12，每兩周1次，共3次；F組為BCG皮下注射組，接種5×107CFU100μL；G組為PBS皮下注射組，注射PBS100μL。疫苗免疫后10w用細粒棘球絳蟲原頭節(jié)腹腔注射感染，每只感染100個原頭節(jié)。攻擊后18w殺鼠，計算其減蚴率，檢測血清IgE、IgG及其亞類和分離脾細胞，應(yīng)用FACSort流式細胞儀檢測T細胞CD4+和C

7、D8+亞群百分比，用棘球蚴囊液抗原和刀豆蛋白A或PHA刺激培養(yǎng)后，檢測其上清液IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α水平。用AnnexinV聯(lián)合PI染色法和TUNEL法檢測疫苗免疫加攻擊后鼠脾細胞凋亡。 結(jié)果：小鼠接種Eg原頭節(jié)4月后，切開腹腔發(fā)現(xiàn)數(shù)個大小不等的包囊，說明棘球蚴模型制作成功。經(jīng)電泳及測序證實從原頭節(jié)擴增出471bpEg95蛋白編碼基因，重組質(zhì)粒pBCG-Eg95經(jīng)酶切及PCR證實成功連接，并經(jīng)PCR鑒定成功轉(zhuǎn)

8、入BCG。在SDS-PAGE上分子量16．5kDa處見明顯表達條帶，Western-blot示重組蛋白具有抗原性，證明構(gòu)建的疫苗是成功的，用Bio-RadQuantityone分析系統(tǒng)分析表明，在rBCG中表達效率為12％左右。 細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗免疫后小鼠IgE、IgG及其亞類的變化結(jié)果，鼻腔粘膜接種組IgG從免疫后2w開始升高，免疫后10w達最高水平，IgGl變化甚微，僅在16w時有明顯降低，IgG2a從免

9、疫后2w開始升高，免疫后6w達最高水平，隨后降低，IgG2b僅在6w時升高，IgG3從免疫后2w開始降低，免疫后12w達最低水平，IgE從免疫后2w開始降低，免疫后16w達最低水平；口服灌胃接種組IgG從免疫后4w開始升高，免疫后14w達最高水平，IgGl變化甚微，僅在8周時有明顯降低，IgG2a從免疫后6w開始升高，免疫后8w達最高水平，IgG2b從免疫后4w開始升高，免疫后8w達最高水平，IgG3從免疫后4w開始降低，免疫后10w達

10、最低水平，IgE從免疫后6w開始降低，免疫后16w達最低水平。提示該疫苗能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平的IgG2a和IgG2b，而IgGl較低，從而提高宿主抗Eg感染的保護性免疫力。 細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后T淋巴細胞亞群變化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組CD4+亞群百分比均從免疫后4w開始升高，免疫后10w達最高水平，且免疫后10w口服灌胃接種組CD4+亞群百分比顯著高于鼻腔粘膜接種組，提示疫苗口服灌胃接

11、種后的免疫效果優(yōu)于鼻腔粘膜接種，CD8+亞群無明顯變化。表明重組BCG-Eg95疫苗使CD4+亞群升高，促進Th1型細胞因子分泌，從而提高宿主抗細粒棘球絳蟲感染的保護力。 細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95免疫后誘導(dǎo)小鼠細胞因子變化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)IL-2水平鼻腔粘膜接種組從免疫后2w開始升高，免疫后8～10w達最高水平；口服灌胃接種組從免疫后4w開始升高，免疫后1Ow達最高水平；IFN-γ鼻腔粘膜接種組從免疫后2w開始升高，免疫后8w

12、達最高水平；口服灌胃接種組從免疫后4w開始升高，免疫后10w達最高水平；IL-4鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組僅在10w時的抗原和ConA刺激時短暫增加；TNF-α鼻腔粘膜接種組和口服灌胃接種組從免疫后2w開始升高，免疫后12w達最高水平，直到18w實驗結(jié)束一直處于較高水平，且前者較高于后者。 疫苗免疫加攻擊后發(fā)現(xiàn)口服灌胃組和肌肉注射組的保護力最好，減蚴率分別為88．05％和92．46％；發(fā)現(xiàn)IgG、IgG1、IgG2a和IgG

13、2b水平在攻擊前后都是增加的，IgG3水平幾乎沒有變化，IgE水平在攻擊前是降低的，在攻擊后是升高的；各組都誘導(dǎo)較高水平的IL-2、IFN-Y和TNF-α，以及低水平的IL-4，說明Thl免疫應(yīng)答占優(yōu)勢。用AnnexinV染色法和TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)免疫加攻擊后小鼠脾細胞細胞凋亡明顯降低，表明疫苗可抑制感染鼠脾細胞發(fā)生凋亡，增加CD4+T細胞亞群的數(shù)量，加強宿主抗細粒棘球絳蟲感染的保護性免疫反應(yīng)。 結(jié)論：從此項研究的實驗結(jié)果可得

14、出如下結(jié)論：①用RT-PCR方法，從Eg原頭節(jié)中獲得Eg95蛋白完整編碼基因。②成功構(gòu)建細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗。③細粒棘球絳蟲Eg95蛋白編碼基因在BCG中穩(wěn)定表達，表達蛋白占BCG總體蛋白的12％。④rBCG-Eg95疫苗采用不同的免疫接種途徑，抗Eg原頭節(jié)攻擊的減蚴率為24．82％～92．46％，其中以口服灌胃組和肌肉注射組的保護力最好。⑤在rBCG-Eg95疫苗免疫組和免疫加攻擊組均產(chǎn)生高水平的IgG、IgG2a和I

15、gG2b抗體，低水平的IgGl和IgG3，IgE水平在攻擊前是降低的，在攻擊后是升高的，提示IgG、IgG2a、IgG2b和IgE可能參與保護性的免疫應(yīng)答機制。⑥用rBCG-Eg95疫苗免疫BALB／c小鼠后，CD4+T細胞明顯增加，CD8+T細胞無明顯變化，Eg原頭節(jié)攻擊后不僅CD4+T細胞增加，CD8+T細胞也有輕度增加，提示疫苗的保護機制不僅有CD4+T細胞的參與，可能也有CD8+T細胞的作用。⑦在rBCG-Eg95疫苗免疫組和免

16、疫加攻擊組均產(chǎn)生高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，低水平的IL-4，提示該疫苗誘導(dǎo)以Th1型免疫應(yīng)答為主的反應(yīng)，它們與免疫細胞相互作用，構(gòu)成抗細粒棘球絳蟲感染的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。⑧細粒棘球絳蟲重組BCG-Eg95疫苗可抑制感染鼠脾細胞發(fā)生凋亡，增加CD4+T細胞亞群的數(shù)量，加強宿主抗細粒棘球絳蟲感染的保護性免疫反應(yīng)。⑨重組BCG疫苗具有以下優(yōu)點：表達的外源抗原不需純化，可直接用于免疫保護試驗，免去蛋白質(zhì)純化的復(fù)雜工序；BCG是活菌苗