第一部分4,5-雙氫-7-去氨甲酰基-7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素及其與格爾德霉素生物合成PKS后修飾的關系;第二部分必特螺旋霉素生物合成調節(jié)基因acyB2在大腸桿菌中的異源表達.pdf

1、第一部分:4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素及其與格爾德霉素生物合成PKS后修飾的關系
　　 格爾德霉素(geldanamycin，GDM)是一種苯（醌型）安莎類抗生素，是分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)的特異性抑制劑，具有抗腫瘤和抗病毒等生物學活性。但是，GDM具有嚴重的肝臟毒性，且水溶性和光穩(wěn)定性較差，限制其開發(fā)成為藥物，因此，它只作為一個重要的抗腫瘤藥物開發(fā)先導化合物。近年來，尋找水溶性好

2、、肝毒性低的格爾德霉素衍生物成為新的研究熱點。
　　 本文通過對吸水鏈霉菌17997格爾德霉素生物合成PKS后修飾gdmNˉ（編碼氨甲酰基轉移酶）變株的次級代謝產物分析，發(fā)現(xiàn)了一個預期的新格爾德霉素衍生物,4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素。gdmNˉ變株發(fā)酵上清液乙酸乙酯提取后，進行硅膠板TLC分析；對一個紅色目標化合物進行HPLC和高分辨質譜分析，并對其進行了1H-和13C-核磁共振分析；對紅色

3、目標化合物在吸水鏈霉菌17997格爾德霉素PKS基因阻斷變株中進行了生物轉化實驗。
　　 結果：顯示：在gdmNˉ變株發(fā)酵產物中發(fā)現(xiàn)了1個預期的紅色目標化合物（4,5-雙氫-7-去氨甲?；?7-羥基-19-S-甲基格爾德霉素）：該化合物可被格爾德霉素生物合成PKS后修飾系統(tǒng)7-O-氨甲酰化，生成4,5-雙氫-19-S-甲基格爾德霉素，但不能C-4,5氧化。
　　 4,5-雙氫-7-去氨甲酰基-7-羥基-19-S-甲基格爾

4、德霉素的發(fā)現(xiàn)，以及早期發(fā)現(xiàn)的19-S-甲基格爾德霉素和4,5-雙氫-19-S-甲基格爾德霉素，加深了對天然存在于吸水鏈霉菌17997格爾德霉素生物合成PKS后修飾系統(tǒng)以外修飾的認識。通過分析生物轉化產物，證實19-S-甲基化修飾對格爾德霉素生物合成PKS后修飾系統(tǒng)中的氨甲?；瘺]有影響，而對C-4,5氧化具有抑制作用。
　　 第二部分:必特螺旋霉素生物合成調節(jié)基因acyB2在大腸桿菌中的異源表達
　　 必特螺旋霉素是由基

5、因工程重組菌StreptomycesspiramyceticusWSJ-1產生的一組以4"異戊酰螺旋霉素為主組分的十六元大環(huán)內酯類抗生素。將來自碳霉素生物合成中的4"異戊?；D移酶（ist,carE或acyB1）基因導入到螺旋霉素產生菌中，所表達的酶可以對螺旋霉素進行4"異戊酰化。
　　 已知acyA和acyB1-acyB2這3個基因，acyA主要負責十六元內酯環(huán)上C3-羥基的乙酰基化。而acyB1-acyB2負責十六元內酯環(huán)C

6、5上連接的糖基的異戊?；?。acyB1基因編碼4"異戊?；D移酶。Arisawa等人推測acyB2基因是acyB1基因的正調控基因，但是acyB2的表達產物對acyB1基因的調控結合位點并不清楚。本研究的目的是確證acyB2基因表達產物的DNA結合區(qū)，為acyB2基因是acyB1基因的正調控基因提供直接證據(jù)；同時，將為應用生物技術手段構建必特螺旋霉素高產菌株提供更加堅實的理論依據(jù)。
　　 我們首先將acyB2基因克隆到pMD18

7、-TSimpleVector上，獲得pMA01基因重組質粒并測序驗證無誤。然后，采用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，切下acyB2基因并插入到冷休克表達載體pColdⅡVector（利用大腸桿菌冷休克基因cspA啟動子序列的蛋白質表達系統(tǒng)，采用低溫誘導方法，蛋白質表達量和可溶性較高）中，獲得pCA01重組質粒。將pCA01重組質粒導入到E．coliCompetentCellBL21中進行異源表達，發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。隨后嘗試更換表

8、達宿主，ChaperoneCompetentCellsBL21系列——分別含有一種伴侶蛋白質粒，能有效表達一組協(xié)同作用、共同參與蛋白折疊的分子伴侶（以增加可溶性蛋白表達水平），但仍沒有獲得可溶性目的蛋白。最后，我們對以包涵體形式表達的目的蛋白進行了純化和復性。
　　 acyB2與acyB1間有段約300bp的DNA片段，我們推測其中可能包含acyB2編碼蛋白的DNA結合區(qū)（以正調控acyB1轉錄表達）。我們設計PCR引物，擴增該

9、300bpDNA片段，標記后作為探針，利用凝膠阻滯實驗，以確證acyB2蛋白的DNA結合位點，但是沒有成功。
　　 第三部分：重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的研究進展
　　 長期以來，大腸桿菌是表達重組蛋白的首選表達系統(tǒng)，但有時表達的目的蛋白卻未進行正確的折疊而形成包涵體。人們在表達不同的目的蛋白時采用了多種方法以期獲得具有生物學功能的蛋白質，包括優(yōu)化培養(yǎng)條件、融合標簽的使用和共表達分子伴侶等。本文綜述了近年來在大腸桿菌