膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞癌變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞癌變的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：將人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用及能否誘導(dǎo)后者發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并鑒定其轉(zhuǎn)化后的生物學(xué)表型。
　　方法：取全身表達(dá)綠色熒光蛋白的C57BL/6J-NC-GFP裸小鼠，腹腔灌洗得到的巨噬細(xì)胞與轉(zhuǎn)紅色熒光基因的人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系SU3-RFP直接及間接共培養(yǎng)，建立雙色熒光示蹤細(xì)胞共培養(yǎng)模型，觀察膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與宿主巨噬細(xì)胞相互作用，觀察巨

2、噬細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞特性的變化，鑒定其生物學(xué)表型的改變。
　　結(jié)果：不論是直接及間接共培養(yǎng)，均可見(jiàn)巨噬細(xì)胞受腫瘤刺激后發(fā)生形態(tài)上的變化。其中直接共培養(yǎng)體系中，早期可見(jiàn)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬。繼續(xù)傳代培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞由小圓形逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，并可連續(xù)傳代，生長(zhǎng)曲線表明此轉(zhuǎn)化的巨噬細(xì)胞具有同SU3細(xì)胞相似的生長(zhǎng)周期及生長(zhǎng)速度，具有惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞特性。
　　結(jié)論：體外雙色熒光細(xì)胞共培養(yǎng)模型中，人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，值得

3、進(jìn)一步深入研究。
　　第二部分：膠質(zhì)瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)宿主巨噬細(xì)胞癌變的體內(nèi)研究
　　目的：腫瘤免疫研究表明，進(jìn)展期腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，本文旨在探索膠質(zhì)瘤干細(xì)胞能否在體內(nèi)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的癌變。
　　方法：將紅色熒光蛋白基因(RFP)轉(zhuǎn)入人腦膠質(zhì)瘤系 SU3，建立穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SU3-RFP，然后將SU3-RFP接種于表達(dá)綠色熒光蛋白基因(GFP)的裸小鼠腹腔，致瘤后取腹水和腫瘤結(jié)節(jié)培養(yǎng)，

4、細(xì)胞單克隆方法得到腫瘤微環(huán)境中的各型細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。單克隆所得到綠色熒光細(xì)胞(GFP+)，連續(xù)傳代培養(yǎng)后建立相應(yīng)細(xì)胞株，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。細(xì)胞爬片后進(jìn)行HE染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。MTT方法繪制此細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定此細(xì)胞集落形成率。將其接種于裸小鼠右前肢腋下，觀察細(xì)胞致瘤性。在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)GFP+細(xì)胞DNA含量，細(xì)胞G顯帶方法對(duì)GFP+細(xì)胞進(jìn)行染色體G顯帶分析，PCR擴(kuò)增cox基因，對(duì)GFP+細(xì)胞進(jìn)行

5、種屬鑒定，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè) GFP+細(xì)胞巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CD68的表達(dá)。
　　結(jié)果：SU3干細(xì)胞球因表達(dá)RFP蛋白而發(fā)紅色熒光。將SU3-RFP細(xì)胞接種于GFP裸小鼠腹腔，其致瘤能力100%，荷瘤鼠血性腹水及腹腔腫瘤結(jié)節(jié)均由發(fā)紅色熒光的SU3-RFP子代細(xì)胞和發(fā)綠色熒光的宿主細(xì)胞組成。將血性腹水或腫瘤結(jié)節(jié)的組織塊在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，都能見(jiàn)到發(fā)紅色(RFP)、綠色(GFP)和黃色(RFP/GFP融合)三種不同熒光顏色的細(xì)

6、胞。單克隆得到的GFP+細(xì)胞，體外培養(yǎng)證實(shí)其具有無(wú)限增殖能力，且兼具下列癌細(xì)胞表型：增殖迅速、細(xì)胞間接觸抑制消失、細(xì)胞集落形成率高、高致瘤率。在流式細(xì)胞儀上測(cè)得其DNA合成能力是正常2倍體鼠淋巴細(xì)胞的2.528倍，為超5倍體(2.528×2)。通過(guò)G顯帶可計(jì)數(shù)染色體條數(shù)為92.70±7.15(N=10)，且為端著絲粒；此GFP+細(xì)胞可擴(kuò)增出種屬特異性鼠cox基因陽(yáng)性產(chǎn)物，另外，此GFP+細(xì)胞還表達(dá)鼠巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CD68。