miR-451在膀胱腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、在我國(guó)，膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤，位居所有惡性腫瘤的第7位；在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，位居男性惡性腫瘤第四位。在膀胱腫瘤切除后約有50-70％患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，10-30%患者進(jìn)展為中晚期侵襲性膀胱癌并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，預(yù)后較差，5年生存率低于50%。因此，深入研究膀胱癌復(fù)發(fā)、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探索新的基因治療靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物，一直是泌尿系腫瘤領(lǐng)域研究的重要課題。
　　miRNA是一種長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，它的種子序列

2、通過(guò)與靶基因mRNA3’UTR部分或完全結(jié)合使靶基因降解或其翻譯過(guò)程被抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平降低相應(yīng)靶基因的調(diào)控作用。miRNA的異常表達(dá)和許多疾病有關(guān)，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著類似腫瘤抑癌基因（miR-29b、MiR-133a，miR-137、miR-145、和MiR-146b）或原癌基因（miR-21、miR-638和miR-200家族)的作用。miR-451位于染色體17qll.2，參與多種疾病的生理及病理過(guò)程的調(diào)控，如：胚

3、胎的發(fā)育過(guò)程、造血系統(tǒng)分化、神經(jīng)系統(tǒng)的分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition EMT)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及心血管疾病的成因。研究發(fā)現(xiàn) miR-451在許多腫瘤組織中存在異常的表達(dá)，并且介導(dǎo)了腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲。
　　近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在上皮性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。miRNA通過(guò)誘導(dǎo)EMT的相關(guān)效應(yīng)分子來(lái)抑制上皮性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)檢測(cè)膀胱腫瘤組織和膀胱癌細(xì)

4、胞中miR-451的表達(dá)水平，分析miR-451與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相互聯(lián)系；然后觀察miR-451表達(dá)改變對(duì)膀胱癌細(xì)胞粘附、遷移、增殖、侵襲及凋亡的影響，并初步探討 miR-451通過(guò)誘導(dǎo)EMT的相關(guān)效應(yīng)蛋白抑制膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　本課題包括以下三部分：第一部分：檢測(cè)miR-451在膀胱癌組織標(biāo)本和膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及分析其與臨床分期、病理分級(jí)之間的相互聯(lián)系；第二部分：觀察miR-451過(guò)表達(dá)

5、對(duì)膀胱癌細(xì)胞粘附、遷移、增殖、侵襲及凋亡的影響；第三部分：研究 miR-451通過(guò)介導(dǎo) EMT的發(fā)生抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　第一部分 miR-451異常表達(dá)及與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)之間的相互聯(lián)系
　　方法：
　　1.收集標(biāo)本，其中膀胱癌組織30例、癌旁組織18例、正常膀胱組織15例。體外培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82。
　　2.應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)miR-451在不同轉(zhuǎn)移潛能膀胱

6、癌細(xì)胞及膀胱癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達(dá)。
　　3.檢測(cè)miR-451在膀胱癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平，應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析其與膀胱癌患者TNM臨床分期、病理分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別、年齡之間的相互聯(lián)系。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：多項(xiàng)指標(biāo)間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析；所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用x±s表示，使用spass19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算，當(dāng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.0

7、5時(shí)，我們認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、qRT-PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示：① miR-451在膀胱癌組織中較在癌旁及正常膀胱組織中低表達(dá)，差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-451在癌旁組織中較正常膀胱組織中低表達(dá)，差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②miR-451在高分化膀胱癌組織中較在低分化膀胱癌組織中高表達(dá)，差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-451在高分期（如T3、T4）膀

8、胱癌組織中較在低分期（如T1、T2）膀胱癌組織中低表達(dá)，miR-451的表達(dá)水平和膀胱癌的臨床分期及病理分級(jí)負(fù)相關(guān)，差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-451在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中較在淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組中明顯低表達(dá)，差異顯著（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-451的表達(dá)水平與病人的性別、年齡無(wú)顯著相關(guān)性；③ miR-451在低度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株J82中呈高表達(dá)，在高度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株T24、5637中呈低表達(dá)，與細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能

9、呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-451在不同轉(zhuǎn)移潛能膀胱腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平較膀胱細(xì)胞中呈顯著低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、Spearman相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析顯示：癌組織中miR-451的表達(dá)水平與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、膀胱癌TNM分期及癌分化程度相關(guān)(P<0.05)，而與病人的性別及年齡無(wú)相關(guān)性（P>0.05）。
　　第二部分：miR-451對(duì)膀胱癌細(xì)胞粘附、遷移、增殖、侵襲和凋亡的影響

10、
　　方法：
　　1、設(shè)計(jì)合成miR-451 mimics、及對(duì)應(yīng)的scramble序列；體外培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用LipofectamineTM2000按照實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
　　2、采用劃痕損傷模型分析miR-451表達(dá)改變對(duì)癌細(xì)胞二維水平遷移能力的影響。
　　3、采用侵襲小室模型分析miR-451表達(dá)改變對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　4、采用細(xì)胞粘

11、附實(shí)驗(yàn)分析miR-451表達(dá)改變對(duì)癌細(xì)胞粘附能力的影響。
　　5、采用MTT增殖實(shí)驗(yàn)分析miR-451表達(dá)改變對(duì)癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　6、采用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)分析miR-451表達(dá)改變對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)提示miR-451mimics及scramble序列在三個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞組中的轉(zhuǎn)染效率都達(dá)85%以上，說(shuō)明轉(zhuǎn)染效果好，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　2、劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：在膀胱癌細(xì)胞實(shí)

12、驗(yàn)中，miR-451過(guò)表達(dá)組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞遷移具體短，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）這說(shuō)明miR-451過(guò)表達(dá)可使膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82的二維遷移能力減弱。
　　3、粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示：在膀胱癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-451過(guò)表達(dá)組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞OD值低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而陰性對(duì)照組及空白對(duì)照

13、組差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明miR-451過(guò)表達(dá)可使膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82的粘附能力減弱。
　　4、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示：在三個(gè)癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-451過(guò)表達(dá)組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組侵襲細(xì)胞總數(shù)少，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明miR-451過(guò)表達(dá)可使膀胱癌T24、5637、J82的侵襲能力減弱

14、。
　　5、MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示：在膀胱癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-451過(guò)表達(dá)組較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞OD值低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這說(shuō)明miR-451過(guò)表達(dá)可抑制T24、5637、J82細(xì)胞的增殖。
　　6、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析顯示：在膀胱癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-451上調(diào)組較miR-451組及陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率高，而miR-45

15、1下調(diào)組較陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見(jiàn) Fig14）。這說(shuō)明上調(diào)/下調(diào)miR-451表達(dá)水平能促進(jìn)/抑制T24、5637細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：研究miR-451通過(guò)調(diào)控EMT抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞T24、5637、J82，分別采用5ng/ml及10ng/ml溶度的TGF-β處理誘導(dǎo)細(xì)胞EMT發(fā)生。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征的

16、變化，選取細(xì)胞形態(tài)變化最顯著的一株細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.設(shè)計(jì)合成miR-451 mimics、miR-451 inhibitor及對(duì)應(yīng)的scramble序列；體外培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞5637，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，使用Lipofectamine TM2000按照實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
　　3.采用Wertern blot法檢測(cè)不同分組癌細(xì)胞中N-Cadherin、Vimentin、E-Cadherin及Snial蛋白的

17、表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞 EMT發(fā)生結(jié)果顯示：在三不同轉(zhuǎn)移潛能的膀胱癌細(xì)胞中，5637是由緊湊的多邊形細(xì)胞向細(xì)長(zhǎng)的梭形樣間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化最顯著的細(xì)胞株。選擇它作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　2、統(tǒng)計(jì)分析顯示：①N-Cadherin及Vimentin在miR-451 inhibitor組中較在miR-451 mimic組、陰性對(duì)照組及空白組中顯著高表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②E-Cadheri

18、n在miR-451 mimic組中較在miR-451 inhibitor組、陰性對(duì)照組及空白組中高表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；③Snail在各組間表達(dá)無(wú)顯著差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；（見(jiàn) Fig16）。結(jié)果提示 miR-451可能通過(guò)調(diào)控EMT相關(guān)蛋白N-cadheri、Vimentin及E-Cadherin表達(dá)而抑制膀胱癌細(xì)胞EMT發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1、miR-451在不同階段的膀胱癌組織、癌旁組織