通用型H1N1甲型流感病毒疫苗的研發(fā)及基于Vero細(xì)胞的高產(chǎn)流感疫苗株的制備.pdf

1、流感病毒是造成歷史上多次流感大流行的病原體，也是引起季節(jié)性流行性感冒發(fā)生的病原體。流感病毒屬于正黏病毒科，分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是造成人和多種動(dòng)物感染的主要病原體。在全世界范圍內(nèi)，每年都會(huì)有大量易感人群因感染流感病毒發(fā)病甚至死亡。由于流感病毒變異速度很快，流感疫苗需要逐年更新，因此具有廣譜保護(hù)效果的通用流感疫苗成為目前流感疫苗研究的方向和熱點(diǎn)。
　　H1N1亞型流感病毒是

2、人群中造成季節(jié)性流行性感冒的主要病原體之一。H1N1亞型人流感病毒的分離株眾多、不同分離株序列差異較大，普通的季節(jié)性流感疫苗不能對(duì)所有毒株都產(chǎn)生保護(hù)作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過“共有序列+保守表位”的方式設(shè)計(jì)出一條針對(duì)H1N1亞型流感病毒的HA蛋白通用序列——CH1-1。在本實(shí)驗(yàn)中，我們用DNA疫苗的方式在小鼠體內(nèi)檢測(cè)了CH1-1所誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答以及細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對(duì)其廣譜反應(yīng)性做以評(píng)價(jià)。結(jié)果表明接種了pCH1-1的小鼠血清對(duì)NC99和

3、FM47病毒有中和活性。免疫小鼠的T細(xì)胞可產(chǎn)生對(duì)SC09、NC99和FM47幾個(gè)代表株病毒抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。為了同時(shí)獲得對(duì)SC09有中和活性的抗體，我們?cè)贒NA免疫組合中加入了表達(dá)SC09的HA的基因，pCH-1和pSC09-HA兩種質(zhì)粒混合免疫小鼠。得到的免疫血清對(duì)包括SC09在內(nèi)的三株病毒都產(chǎn)生很強(qiáng)的交叉中和活性；SC09、NC99、FM47三種抗原體外刺激T細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清中IFNγ含量都有很大提高?；旌腺|(zhì)粒免疫過的小鼠能抵

4、抗致死劑量SC09、NC99和FM47等病毒的攻擊，病毒攻毒免疫小鼠的肺臟病變明顯減弱，攻毒14天后小鼠肺內(nèi)未檢測(cè)到病毒殘留，這說明兩種抗原的組合能誘導(dǎo)對(duì)許多種 H1N1病毒的廣譜免疫應(yīng)答。用CH1-1基因替換PR8病毒的HA基因構(gòu)建的重組病毒株P(guān)R8-CH1-1是一株天然的弱毒株。PR8-CH1-1滴鼻免疫小鼠后用SC09和NC99兩株病毒檢測(cè)保護(hù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有免疫過的小鼠在用致死劑量的兩株病毒攻毒后均得到很好的保護(hù)，死亡率為0

5、，肺臟只有輕微病變，攻毒14天后小鼠肺內(nèi)未檢測(cè)到病毒殘留。這說明以PR8-CH1-1作為減毒活疫苗能誘導(dǎo)對(duì)許多種H1N1病毒的廣譜保護(hù)性免疫應(yīng)答。
　　甲型流感病毒一直威脅人類健康,接種疫苗是預(yù)防甲型流感病毒感染的有效途徑。哺乳動(dòng)物二倍體細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是生產(chǎn)甲型流感疫苗的新一代培養(yǎng)介質(zhì)。在前期工作中通過病毒基因組改造，我們已經(jīng)獲得Vero細(xì)胞高產(chǎn)的流感病毒疫苗骨架株，本研究將基于該Vero細(xì)胞高產(chǎn)骨架株構(gòu)建H7N9甲型流感病毒疫苗株

6、，研究和檢驗(yàn)該高產(chǎn)疫苗骨架株是否支持新近流行的H7N9亞型流感病毒疫苗株在Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)，為應(yīng)對(duì)人感染H7N9病毒提供細(xì)胞介質(zhì)疫苗候選株。首先通過甲型流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)，將H7N9亞型流行株的HA和NA基因（2條編碼病毒表面蛋白的基因）與Vero細(xì)胞高產(chǎn)疫苗骨架株P(guān)R8-4mut的PB1、PB2、PA、NP、M、NS基因（6條編碼病毒內(nèi)部蛋白的基因），通過6+2重組法拯救出4mut-H7N9病毒。同時(shí)拯救對(duì)照病毒PR8-H7N

7、9（HA、NA來自于H7N9,6條編碼病毒內(nèi)部蛋白的基因來自于野生型 PR8病毒）。通過生長(zhǎng)曲線和空斑形態(tài)等病毒學(xué)方法比較PR8-H7N9和4mut-H7N9兩株病毒在Vero細(xì)胞上的生長(zhǎng)性狀；通過免疫印跡和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)4mut-H7N9病毒產(chǎn)量最高時(shí)間點(diǎn)時(shí)，PR8-H7N9和4mut-H7N9兩株病毒的特定蛋白或大部分蛋白的產(chǎn)量差異。對(duì)比兩株病毒的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，感染后72小時(shí)4mut-H7N9的病毒滴度比PR8-H7N9滴度高約

8、3000倍；空斑實(shí)驗(yàn)顯示，培養(yǎng)48小時(shí)后，4mut-H7N9在Vero細(xì)胞上形成直徑約1毫米的空斑，而PR8-H7N9只能形成針孔大小的空斑；考馬斯亮藍(lán)染色比較兩株病毒總蛋白含量表明，兩株病毒以相同MOI感染Vero細(xì)胞后72小時(shí)收集的上清中，4mut-H7N9各病毒蛋白組分含量均遠(yuǎn)高于PR8-H7N9；用免疫印跡法檢測(cè)兩株病毒上清中PA、NP和M1蛋白的相對(duì)含量得到了與考馬斯亮藍(lán)染色相似的結(jié)果；4mut-H7N9病毒沒有改變胰酶依賴性