治療性抗體通用真核表達載體的構建.pdf

1、研究背景 惡性腫瘤嚴重危害人們的健康，據(jù)WHO統(tǒng)計，在全世界50多億人口中平均每年死于惡性腫瘤者達690萬人，新發(fā)病例為870萬例，且數(shù)字還在逐年增加。在我國，根據(jù)衛(wèi)生部2004年公報資料，2003年惡性腫瘤仍穩(wěn)居我國部分市縣疾病死因之首。 淋巴瘤起源于淋巴結或其他淋巴組織，分為霍奇金病(Hodgkindisease，HD)和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkinlymphoma,NHL)兩大類，其中以B淋巴細胞最為常見。

2、 在本篇論文中主要涉及到B細胞性非何杰金氏淋巴瘤。非何杰金氏淋巴瘤是一種常見的惡性淋巴腫瘤，治療非何杰金氏淋巴瘤有很多常規(guī)方法，以放療和化療為主，但放療和化療毒副作用大且選擇性不強，在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常組織細胞也有毒害作用，而且很容易產生內在性或獲得性多藥耐藥(Multi-drugresistance，MDR)和復發(fā)，并且對中度和高度惡化的B-cellNHL的緩解率很低。因此只殺傷腫瘤細胞而正常細胞不受損害的靶向治療一直

3、受到關注。單克隆抗體因其特異性高，本身具有細胞毒作用，可攜帶藥物，毒物和放射性同位素而成為靶向治療的主要策略。 目前腫瘤的單克隆抗體導向治療是一個研究十分活躍的領域，且取得了可喜的成果。對非霍奇金淋巴瘤(NHL)的單克隆抗體導向治療就是一個較為成功的例子，目前臨床治療效果最好的還是抗CD20抗體。 但由于抗體片段Fab'及F(ab')2是抗原結合活性片段，缺少Fc段細胞生物學功能，且Fab'及F(ab')2的分子量較小，

4、因此血漿半衰期比較短，影響了它的療效。 目的 本實驗主要構建用于表達治療B淋巴細胞非何杰金氏淋巴瘤的抗CD20基因工程抗體的真核表達載體。研制的該抗體片段已擁有我國獨立知識產權，與國外同類產品相比有以下優(yōu)勢：基因工程抗體片段誘導腫瘤細胞凋亡作用更強；與CD20抗原結合的表位不同，可能在抗B-cellNHL耐藥方面更具有優(yōu)勢，研制成功后有望取代國外同類產品。真核表達載體的優(yōu)勢在于：真核中抗體蛋白可正確折疊和糖基化，產生更接

5、近人的結構分子，將有更好的活性；因為全抗大分子在原核中產量較低，因此在真核表達，相對于原核，產量將有所提高。 研究方法 主要通過基因工程及分子生物學方法，采用PCR手段，分別合成全抗體的輕鏈和重鏈，通過限制性內切酶酶切，利用5'和3'的黏性末端，連接等方法，將抗體片段導入真核表達載體質粒PEE14中，轉化入感受態(tài)細胞，涂于含有amp的瓊脂糖凝膠的平板上，過夜生長然后通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳鑒定出含有導入質粒的陽性菌株，

6、交由生物公司測序。然后通過構建的分別含有抗CD20全抗體輕鏈和重鏈的PEE14質粒，通過多克隆接頭，改造PEE14質粒，消除SalI位點，加入notI位點，然后通過中間載體pcdna3.1，將輕鏈和重鏈基因同時轉入同一真核表達載體PEE14中。 結果 構建了分別含有抗CD20全抗體輕鏈和重鏈的PEE14質粒； 改造了pcdna3.1過渡載體，去掉了一個SalI位點，加入了NotI位點。 構建了抗CD20全