全人抗體高效真核表達載體的構建與表面重塑抗體rCAb1.pdf

1、本實驗以HAb18G/CD147-HAb18抗原抗體系統(tǒng)為基礎，構建并篩選了用于全人抗體表達的高效真核載體；之后，克隆了抗人大腸癌抗體CAb1輕、重鏈可變區(qū)基因VH和VL，通過制備復性的嵌合cFab對獲得的基因的可靠性和準確性進行驗證；進而以獲得的CAb1的VH和VL為基礎，對其進行人源化表面重塑抗體rCAb1設計；最終，選用鑒定的抗體真核表達載體，實現(xiàn)了重組rCAb1在哺乳動物細胞中的表達。
　　第一部分研究內容：高效全人抗體真

2、核表達載體的構建及篩選
　　目的：獲得具有自主產(chǎn)權，且能表達全人抗體的高效真核表達載體
　　方法：按照標準DNA重組操作，構建以下不同的真核表達載體：包括弱化多順反子pIRES1-18L;pIRES2-18H；定點重組載體18-pDHL-FRT；雙載體系統(tǒng)18H-pDHA，18L-pCI；反向雙載體系統(tǒng)18H-PCI，18L-p105；多順反子表達載體18H-L-pCI-FRT；弱化篩選標記載體18H-L-pCII；以及pA

3、H/pAG雙載體pAH4604-18，pAG4622-18，這些載體均含有單抗HAb18輕重鏈可變區(qū)基因和人IgG1κ的輕、重鏈恒定區(qū)基因。之后，將這些載體分別轉染COS-7細胞，斑點雜交檢測培養(yǎng)上清的情況，觀測是否有嵌合抗體cHAb18的表達；用夾心ELISA法檢測重組抗體的表達量。隨后，選用部分構建載體，用電穿孔穩(wěn)定轉染不同表型的CHO細胞，有限稀釋進行陽性克隆篩選，完成轉染細胞的篩選；RT-PCR檢測穩(wěn)定傳代的細胞系，觀察抗體基因

4、是否丟失，評估轉染載體的細胞穩(wěn)定性。進行陽性克隆的擴大培養(yǎng)，表達產(chǎn)物的純化；SDS-PAGE凝膠電泳及其Westernblot檢測抗體的表達情況；選用細胞免疫熒光染色以及流式細胞檢測表達產(chǎn)物的特異性。
　　結果：構建了含有抗體基因的不同的真核載體，通過必要的PCR或酶切鑒定插入序列，均獲得了和理論上大小一致的片段，提示所有的載體均成功構建。將其全部瞬時轉染COS-7細胞，斑點雜交結果顯示，與未轉化的細胞相比，除載體18H-L-pC

5、II與雙載體pAH/pAG沒有檢測到表達的IgG外，其余的載體均能檢測到抗體的表達；而用抗原HAb18G/CD147胞外區(qū)進行的夾心ELISA結果證實：所有重組表達載體轉化后均能成功檢測到嵌合抗體cHAb18的表達，所有的載體均在轉染48h后表達量達到較高水平，120h后表達量達到最高；其中雙載體pIRES1-18L/pIRES2-18H和pDHL-18FRT的量約達到1.4mg/L。進一步選用三種不同的載體pIRES1-18L/pIR

6、ES2-18H，pDHL-18FRT和18H-L-pCII進行穩(wěn)定轉染不同表型的CHO細胞。夾心ELISA結果顯示上述不同的三種載體均較未轉化的細胞有人IgG的表達，其中雙載體系統(tǒng)pIRES1-18L/pIRES2-18H的表達量約介于0.3-16mg/L;載體pDHL-18FRT的表達量可達到10mg/L；但是載體18H-L-pCII的抗體表達量，在進行克隆化并加壓篩選的情況下卻沒有太多的變化，表達量均少于1.5mg/L。對pIRES

7、1-18L/pIRES2-18H轉染后的細胞株1F6，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)30代，RT-PCR仍能檢測到抗體基因的表達；進一步擴大培養(yǎng)，親合層析柱從約500ml的培養(yǎng)上清中純化，獲得約了7.5mg的表達產(chǎn)物，產(chǎn)物的純度較高。SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測結果：目的蛋白分子量約為150kDa，還原后為兩條帶，分子量約為50kDa和25kDa，符合人IgG抗體的特征，且可以和羊抗人IgG結合。免疫熒光結果顯示表達純化的抗體可特異結

8、合表達有HAb18G/CD147的細胞。
　　結論：通過對載體的優(yōu)化設計和改造，獲得了能用于全人抗體表達的高效真核載體；其中以弱化多順反子pIRES1-18L;pIRES2-18H以及定點重組載體18-pDHL-FRT表達量較高，均可進一步用于其他抗體的表達。成功的篩選了抗HAb18G/CD147的嵌合IgG抗體cHAb18的穩(wěn)定細胞株，并在哺乳動物細胞中獲得高效表達，表達產(chǎn)物保持了良好的特異性和親合力。純化了重組表達的目標全長I

9、gG產(chǎn)物即人鼠嵌合抗體cHAb18，從而也進一步驗證了所獲得的表達載體是正確的且能用于表達全長人IgG。
　　第二部分研究內容：抗人大腸癌單抗CAb1輕、重鏈基因克隆與鑒定
　　目的：獲得單抗CAb1的輕、重鏈可變區(qū)基因，及其嵌合Fd或嵌合輕鏈基因，制備相應的小分子抗體cFab對所獲得的基因進行鑒定。
　　方法：首先，從雜交瘤細胞CAb1提取總RNA，設計并選用合成引物，通過反轉錄PCR擴增單抗CAb1Fd和輕鏈全長基

10、因，連接人T載體后進行序列測定和分析；然后用同源比較對單抗CAb1完整Fd的擴增，獲得含有全長的Fd和輕鏈基因的載體pMD18-T/Fd和pMD18-T/L；分別以pMD18-T/Fd和pMD18-T/L為模版，用對應的引物B4、B4for和A8、A8for擴增MAbCAb1重、輕鏈可變區(qū)基因VH和VL，分別插入含有人CH1和CL的表達載體pComb3C后獲得載體pComb3C/cFab；以載體pComb3C/cFab為模板，再次采用相

11、應的引物擴增嵌合Fd或嵌合輕鏈基因，用相應的限制性內切酶分別消化質粒pET32a（+）及純化的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過連接轉化鑒定獲得載體pET-CAbH和pET-CAbL。誘導表達含有重組表達質粒的菌株，分別表達嵌合cFd和cL并進行純化。將其分別溶解后，按絕對量等摩爾量比混合，用梯度透析的方法進行復性。SDS-PAGE和Westernblot對嵌合Fab進行檢測，觀察產(chǎn)物的復性情況；用ProteinG的柱子純化產(chǎn)物后，選用間接ELISA，免

12、疫熒光染色，流式細胞術檢測復性產(chǎn)物的靶抗原結合活性，最后采用競爭性ELISA檢測該小分子抗體和鼠源單抗CAb1是否競爭同一個抗原表位。
　　結果：從1×107的雜交瘤細胞CAb-1細胞中獲得總RNA量約62.5μg。甲醛變性電泳顯示總RNA比較完整，能夠準確清晰的觀察到5S，18S和28S的銳利條帶。獲得mAbCAb1基因序列，VH基因長351bp，編碼117個氨基酸；VL基因長336bp，編碼112個氨基酸；CAb-1CH1屬于

13、IgG1，CL屬于κ型。優(yōu)化其mRNA的二級結構自由能，構建了非融合表達載體pET-CAbH，pET-CAbL，成功實現(xiàn)了抗體的嵌合Fd或嵌合輕鏈在大腸桿菌中的高效表達，蛋白表達量在30°C誘導6h后分別達到菌體總蛋白的23.6％和29.2％。通過體外復性，SDS-PAGE結果顯示在起始總蛋白濃度100μg/ml時，復性的cFab的回收率高達70.2％。免疫熒光和FACS的結果顯示復性的cFab能夠比較特異的結合到大腸癌細胞系SW480

14、和Hce-8693，但是卻不和正常的細胞結合。競爭ELISA檢測顯示復性的cFab和親本CAb-1抗體片段F(ab')2互相競爭相同表位。
　　結論：獲得了雜交瘤細胞CAb1的輕重鏈可變區(qū)基因，所設計的引物對鼠IgG1類抗體基因的擴增是有效的。表達并制備了嵌合cFd和cL，優(yōu)化mRNA的二級結構自由能對蛋白的非融合表達具有重要作用。實現(xiàn)體外復性制備小分子cFab，該分子能特異的結合大腸癌細胞，所獲得的分子具有結合活性；復性的cFa

15、b能和親本的CAb-1相互競爭，提示它們識別的抗原表位一致；由于制備的cFab抗原有結合活性，進一步提示所獲得雜交瘤細胞CAb1基因是正確和可靠的，同時也印證了該方案對鑒定所克隆的CAb1可變區(qū)基因的有效性。
　　第三部分研究內容：抗人大腸癌表面重塑抗體rCAb1表達和純化
　　目的：用構建的真核表達載體制備抗人大腸癌表面重塑抗體rCAb1，對表達的抗體進行初步純化和鑒定
　　方法：首先通過對大腸癌單抗CAb1的抗體可

16、變區(qū)序列分析，并同Genbank的nr庫做BlastP，從中抽取所有抗體可變區(qū)氨基酸序列信息構建本地抗體結構數(shù)據(jù)庫。進而將抗體種屬來源結合輕、重鏈類型將抗體序列分為四類，其中抗體序列來源分別選擇Homosapiens和Musmusculus兩類。對相似性得分最高的人源、鼠源抗體可變區(qū)序列各200條進行統(tǒng)計，獲得單抗CAb1的差異殘基和異常殘基；之后通過模建抗體可變區(qū)的精確三維模型，獲得CAb1的VH、VL分子內和分子間氫鍵相互作用，最終

17、確定進行人源化改造的候選突變位點；依據(jù)確定的候選位點，對突變后的抗體人源化可變區(qū)序列用重疊PCR的方法合成，分別與T載體（pMD18-T）連接構建成克隆載體pMD18-T/VH和pMD18-T/VL進行序列測定。利用上述的可變區(qū)序列，分別構建輕鏈表達載體pIRES1-CAbL和重鏈表達載體的pIRES2-CAbH（弱化多順反子系統(tǒng)），用PCR和相應的酶切鑒定。將獲得的雙載體轉染COS-7細胞進行瞬時表達，夾心ELISA法檢測抗體的表達情

18、況。最后，將這兩個載體共轉CHO-dhfr-細胞，夾心ELISA法檢測產(chǎn)物的表達情況；用有限稀釋法進行陽性克隆的篩選，擴大培養(yǎng)后進行抗體表達產(chǎn)物的純化，純化樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分析和Westernblot檢測。細胞免疫熒光染色以及流式細胞檢測觀察純化產(chǎn)物對大腸癌細胞的結合活性。最后選用競爭性ELISA檢測該rCAb1是否與親本鼠CAb1競爭同一表位，同時根據(jù)50％抑制率時的人源抗體與親本鼠抗體濃度的比值，估計該人源化IgG的

19、相對親和力。
　　結果：按照Kabat、Abm、Chothia和Contact的規(guī)則標出了大腸癌單抗CAb1的不同的CDR，SDR區(qū)；經(jīng)過篩選的抗體序列經(jīng)過分析，獲得了已有抗體分子不同位點上氨基酸種類和百分比，將該結果和單抗CAb1的可變區(qū)氨基酸比對后，獲得了該序列的差異殘基和異常殘基；結合三維重建模型，獲得了CAb1VH、VL分子內和分子間氫鍵相互作用和氨基酸表面可及性，并最終確定了初步進行人源化改造的候選突變位點即重鏈的T01

20、8S，N086S和輕鏈的Q018P。重疊PCR合成突變的基因后，分別與T載體連接，獲得了克隆載體pMD18-T/VH和pMD18-T/VL，測序結果顯示可變區(qū)基因成功合成。構建的輕鏈表達載體pIRES1-CAbL和重鏈表達載體的pIRES2-CAbH經(jīng)轉染COS-7細胞后，夾心ELISA證明存在人IgG的表達；將這兩個載體共轉CHO-dhfr-細胞，經(jīng)過克隆篩選，表達產(chǎn)物的純化，SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測結果表明：