CTLA4-Ig重組慢病毒引流淋巴結(jié)定向表達(dá)的研究.pdf

1、新型免疫抑制藥物的研制及發(fā)展，為整形外科在異體復(fù)合組織移植領(lǐng)域的穩(wěn)步發(fā)展帶來了新的機(jī)遇。然而，異體復(fù)合組織移植（CTA）的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)不似內(nèi)臟器官移植一樣迅速，究其根本，是因?yàn)楫愺w復(fù)合組織移植物組分復(fù)雜，并且抗原性不均一。自1998年首次手移植被Dubernard成功實(shí)施以來，到目前為止,在臨床上已完成超過60例手移植和23例異體顏面移植。第一例異體顏面移植在法國成功施行手術(shù)后，曾經(jīng)發(fā)生2次急性排斥反應(yīng)，第二例患者是在本科室成功實(shí)施后，術(shù)后

2、也發(fā)生了3次急性排斥反應(yīng)。加大免疫抑制劑用量是使排斥反應(yīng)得到控制的有效方法，但是往往會(huì)出現(xiàn)各種棘手的并發(fā)癥如急性腎衰、高血壓癥等。鑒于上述原因，尋找可以使免疫抑制劑用量最小化的方法，已成為CTA移植領(lǐng)域重點(diǎn)研究的項(xiàng)目。
　　免疫應(yīng)答的一般規(guī)律同樣適用于異體復(fù)合組織移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，首先，外來的異體抗原被免疫識(shí)別之后激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，繼而產(chǎn)生對(duì)移植物的免疫排斥反應(yīng)，也就是說，阻斷免疫應(yīng)答中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)，都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)移植免疫耐受的

3、誘導(dǎo)。
　　細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4抗體融合蛋白（CTLA4-Ig）可以阻斷CD28-B7途徑，能有效誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生。樹突狀細(xì)胞毋庸置疑是最主要的抗原提呈細(xì)胞，在其表面可以高水平表達(dá)MHC-II類分子以及CD80、CD86等共刺激分子，通過B7分子與CD28的結(jié)合，開啟第二信號(hào)刺激途徑，從而激活初始T細(xì)胞。成熟的樹突狀細(xì)胞具有淋巴歸巢的特性，因此，CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染的成熟樹突狀細(xì)胞有可能成為細(xì)胞回輸治療方案的備

4、選細(xì)胞。
　　目的：
　　研究CTLA4-Ig直接淋巴結(jié)注射后其表達(dá)效率、CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染成熟樹突狀細(xì)胞后相關(guān)基因的表達(dá)，局部注射轉(zhuǎn)染后的成熟樹突狀細(xì)胞后觀察CTLA4-Ig在引流淋巴結(jié)內(nèi)的表達(dá)，探索淋巴結(jié)直接基因治療方法的可行性；試圖通過局部細(xì)胞治療誘導(dǎo)免疫耐受，降低全身免疫抑制劑的用量，為同種異體復(fù)合組織移植探索新途徑。
　　方法：
　　1．大鼠淋巴結(jié)內(nèi)注射CTLA4-Ig重組慢病毒，觀察CTL

5、A4-Ig在淋巴結(jié)內(nèi)的表達(dá)。
　　2．貼壁培養(yǎng)法體外誘導(dǎo)成熟樹突狀細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、活性及表型鑒定，體外鑒定其免疫學(xué)功能。
　　3．體外試驗(yàn)研究CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠成熟樹突狀細(xì)胞，觀測(cè)CTLA4-Ig的表達(dá)時(shí)間及表達(dá)高峰。
　　4．體內(nèi)試驗(yàn)研究CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染的成熟樹突狀細(xì)胞于大鼠引流淋巴結(jié)的定向表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．實(shí)時(shí)熒光定量PCR及冰凍切片示，空白對(duì)照及陰性對(duì)照組

6、淋巴結(jié)內(nèi)均無CTLA4-Ig的表達(dá)。CTLA4-Ig重組慢病毒淋巴結(jié)內(nèi)注射組有明顯的CTLA4-Ig表達(dá)。
　　2．光鏡見培養(yǎng)的成熟樹突狀細(xì)胞集落分散，懸浮，分布較均勻。掃描電鏡見細(xì)胞表面大量褶皺與粗細(xì)不等的突起。流式細(xì)胞術(shù)顯示成熟樹突狀細(xì)胞表面的DC功能相關(guān)抗原MHCII、CD80、CD86均高表達(dá)。功能試驗(yàn)檢測(cè)其分泌IL-12能力較未成熟樹突狀細(xì)胞強(qiáng)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示其有強(qiáng)的刺激T細(xì)胞增殖的能力?；罴?xì)胞率為（80.34±1

7、.25）％。
　　3．慢病毒轉(zhuǎn)染成熟樹突狀細(xì)胞76h后，于倒置熒光顯微鏡下可觀察到熒光表達(dá)。隨時(shí)間延長，熒光表達(dá)增多，細(xì)胞形態(tài)亦出現(xiàn)老化。轉(zhuǎn)染后第7d細(xì)胞明顯老化。Q-PCR示CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染成熟樹突狀細(xì)胞第3天，于mRNA水平有CTLA4-Ig的表達(dá)，westernblotting檢測(cè)所示結(jié)果與Q-PCR一致。
　　4．距大鼠腋固有淋巴結(jié)處2公分皮下緩慢注射所收獲的CTLA4-Ig重組慢病毒轉(zhuǎn)染后第3天的DC