引流淋巴結(jié)在異體復(fù)合組織移植中的作用研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著免疫抑制藥物的不斷發(fā)展和聯(lián)合免疫抑制方案的不斷進(jìn)步，臨床器官移植取得了巨大的成功，含有皮膚的同種異體復(fù)合組織移植（CTA）也進(jìn)行了初步的嘗試，并取得良好的效果。但是，終身使用免疫抑制藥物帶來(lái)的各種毒副作用延緩了CTA的進(jìn)一步發(fā)展。在更好的免疫抑制藥物出現(xiàn)之前，如何降低現(xiàn)有免疫抑制藥物的全身使用劑量成為研究的熱點(diǎn)。而帶有皮膚的CTA多位于體表，易于觀察和干預(yù)，因此，有效的局部免疫抑制有望降低全身免疫抑制用藥量。
　　移植

2、免疫反應(yīng)是以T細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答為主。血循環(huán)中的初始T細(xì)胞在次級(jí)淋巴組織與載有抗原的抗原提呈細(xì)胞（APCs）經(jīng)過(guò)反復(fù)接觸、識(shí)別，初始T細(xì)胞逐漸成熟，并增殖成為效應(yīng)T細(xì)胞，再次進(jìn)入血液循環(huán)，到達(dá)異體移植物局部后，促使移植物發(fā)生排斥反應(yīng)。CTA的發(fā)展之所以滯后于器官移植，是因?yàn)槠つw的強(qiáng)免疫源性，因此解決了皮膚的移植排斥反應(yīng)將推動(dòng)CTA的發(fā)展。而皮膚移植物的異體抗原被APCs攝取后，只能沿著淋巴引流進(jìn)入引流淋巴結(jié)，很難有大量的抗原通過(guò)血液進(jìn)入

3、脾或其他部位的淋巴結(jié)。因此，如果能夠有效的干預(yù)引流淋巴結(jié)，就可能顯著減少效應(yīng)T細(xì)胞的產(chǎn)生，減輕移植物的排斥反應(yīng)，進(jìn)而降低免疫抑制藥物的全身用藥量，減少毒副作用。因此，本研究擬針對(duì)引流淋巴結(jié)在CTA中的作用進(jìn)行研究。
　　實(shí)驗(yàn)一：大鼠淋巴結(jié)解剖及異體移植模型的選擇
　　目的：通過(guò)大鼠全身淋巴結(jié)的解剖，各部位引流淋巴結(jié)的確定，對(duì)比研究各種移植模型的引流淋巴結(jié)，為淋巴結(jié)干預(yù)研究選擇適當(dāng)?shù)囊浦材Ｐ?。方法：?duì)SD封閉群、Lewis近交

4、系大鼠分別進(jìn)行全身淋巴結(jié)解剖，記錄淋巴結(jié)的全身分布位置、形態(tài)特征、數(shù)量、重量及單位重量細(xì)胞濃度，比較不同品系間、不同體重大鼠間淋巴結(jié)重量、單位重量細(xì)胞濃度的差異；大鼠備選皮瓣局部皮下注射美蘭，解剖大鼠，定位染色的引流淋巴結(jié)；通過(guò)分析比較不同移植模型的解剖及引流淋巴結(jié)確定本實(shí)驗(yàn)移植模型。結(jié)果：2個(gè)品系大鼠淋巴結(jié)的分布基本明確，無(wú)明顯變異，數(shù)量、重量恒定，SD封閉群大鼠淋巴結(jié)較Lewis大鼠略重，淋巴結(jié)重量隨大鼠體重的增加而增加。經(jīng)顏面部、

5、側(cè)胸、下腹部皮瓣引流淋巴結(jié)的確定及三種皮瓣手術(shù)難度的評(píng)估，確定以下腹部皮瓣為最佳，選定為本研究移植模型。并成功建立下腹部游離皮瓣移植模型，并通過(guò)術(shù)后淋巴結(jié)的解剖驗(yàn)證了下腹部游離皮瓣的引流淋巴結(jié)的部位。結(jié)論：下腹部皮瓣的引流淋巴結(jié)為對(duì)側(cè)腹股溝淋巴結(jié)、同側(cè)腋固有淋巴結(jié)、同側(cè)髂內(nèi)淋巴結(jié)，該皮瓣移植模型是淋巴結(jié)干預(yù)實(shí)驗(yàn)的最佳移植模型。
　　實(shí)驗(yàn)二：雷帕霉素腹腔注射對(duì)大鼠異體皮瓣移植的作用
　　目的：通過(guò)雷帕霉素腹部注射對(duì)大鼠腹部皮瓣

6、存活的影響研究確定雷帕霉素的最低有效免疫抑制劑量。方法：以BN大鼠為供體、Lewis大鼠為受體，進(jìn)行下腹部游離皮瓣異體移植；將雷帕霉素原料藥配置成1mg/mL的雷帕霉素腹腔注射劑，根據(jù)雷帕霉素使用劑量8、4、2、1、0mg/kg/day分為A、B、C、D、E5組，用藥時(shí)間-1—7天；觀察各組皮瓣存活時(shí)間、存活質(zhì)量、病理表現(xiàn)，確定雷帕霉素最低有效免疫抑制劑量。結(jié)果：總實(shí)驗(yàn)例數(shù)36例，有效例數(shù)29例。各組大鼠平均存活時(shí)間分別為17.3±1.

7、7天（A組）、17.5±1.7天（B組）、14.2±1.3天（C組）、7.3±0.6天（D組）、7.3±0.5天（E組）。結(jié)論：選擇2mg/kg/day雷帕霉素劑量作為最低有效免疫抑制劑量。
　　實(shí)驗(yàn)三：去除引流淋巴結(jié)對(duì)大鼠異體皮瓣存活的影響
　　目的：通過(guò)去除大鼠下腹部皮瓣的引流淋巴結(jié)，確定其對(duì)皮瓣存活的影響。方法：BN大鼠為供體、Lewis大鼠為受體，將大鼠隨機(jī)分為5組，A組：移植術(shù)前2周開(kāi)腹假手術(shù)對(duì)照；B組：移植術(shù)前2

8、周開(kāi)腹假手術(shù)，雷帕霉素2mg/kg/day全身用藥（－1～7天）；C組：移植術(shù)前2周去除引流淋巴結(jié)；D組：移植術(shù)前2周去除引流淋巴結(jié)及脾；E組：移植術(shù)前2周去除引流淋巴結(jié)，雷帕霉素2mg/kg/day全身用藥（－1～7天）。術(shù)后通過(guò)觀察動(dòng)物存活率、皮瓣平均存活時(shí)間、血清IL-2水平等指標(biāo)評(píng)價(jià)去除引流淋巴結(jié)對(duì)皮瓣存活的影響。對(duì)移植前2周，移植同時(shí)、移植后3天不同時(shí)間去除引流淋巴結(jié)對(duì)皮瓣存活時(shí)間的影響也進(jìn)行了研究。結(jié)果：各組的平均存活時(shí)間分

9、別為7.3±0.5天（A組），14.4±0.3天（B組），9.5±1.0天（C組），8.8±0.8天（D組）、17.0±1.9天（E組）。B、E組血清IL-2水平明顯低于A、C、D組；C、D組的IL-2水平比A組略高。術(shù)前14天、術(shù)中、術(shù)后3天不同時(shí)間去除引流淋巴結(jié)，移植后皮瓣存活天數(shù)無(wú)明顯差異。結(jié)論：去除引流淋巴結(jié)可以延長(zhǎng)皮瓣平均存活時(shí)間，結(jié)合低劑量雷帕霉素免疫抑制可以延長(zhǎng)皮瓣存活時(shí)間。
　　實(shí)驗(yàn)四：淋巴結(jié)、淋巴引流在移植免疫中

10、的機(jī)制研究
　　目的：通過(guò)研究淋巴結(jié)對(duì)異體移植物的反應(yīng)、阻斷淋巴引流對(duì)移植物存活的影響，探討淋巴結(jié)、淋巴引流在移植免疫中的機(jī)制。方法：BN為供體、Lewis為受體，下腹部異體皮瓣移植術(shù)后1、3、5、7、9天不同時(shí)間解剖淋巴結(jié)，同Lewis自體分離腹部皮瓣保留血管蒂再縫合回去作為對(duì)照，對(duì)兩組大鼠不同時(shí)間摘取的引流淋巴結(jié)和非引流淋巴結(jié)進(jìn)行稱(chēng)重、細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞分析CD4+CD25+細(xì)胞的變化，分析引流淋巴結(jié)在異體移植后的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)

11、去除引流淋巴結(jié)的Lewis大鼠進(jìn)行BN下腹部游離皮瓣移植后，獲取非引流淋巴結(jié)，觀察其大體變化、重量變化、細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞分析來(lái)判斷非引流淋巴結(jié)是否受異體移植物的影響。建立SD→SD、BN→Lewis的隔離皮膚或不隔離皮膚的皮管移植模型，通過(guò)阻斷皮膚淋巴引流觀察皮管存活時(shí)間及質(zhì)量。結(jié)果：移植后的引流淋巴結(jié)逐漸充血、腫大、重量增加，細(xì)胞密度增高，流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+細(xì)胞較非引流淋巴結(jié)增多。異體移植及單純炎癥均可導(dǎo)致引流淋巴結(jié)

12、重量增加、單位重量細(xì)胞濃度增加，但移植導(dǎo)致淋巴結(jié)重量的增加高于炎癥所致，單位重量細(xì)胞濃度無(wú)明顯差別，但較兩組的分引流淋巴結(jié)均有明顯差別。去除引流淋巴結(jié)后移植術(shù)后，非引流淋巴結(jié)未發(fā)現(xiàn)明顯充血及腫大。隔絕皮膚淋巴引流的SD→SD皮管移植物最長(zhǎng)存活至32天，未隔絕供、受體皮膚接觸的SD→SD及兩組BN→Lewis的皮管移植均未能長(zhǎng)期存活。結(jié)論：引流淋巴結(jié)是同種異體移植后主要反應(yīng)部位，隔絕皮膚淋巴引流供、受體間在較小的MHC差異下可明顯延長(zhǎng)異體