異體復(fù)合組織移植中血管化骨髓的致耐受研究.pdf

1、【背景】
　　嚴(yán)重?zé)?、?chuàng)傷往往伴有深部軟組織和骨組織缺損，由于缺損組織多、面積大，傳統(tǒng)“拆東墻補(bǔ)西墻”的修復(fù)方式一般無法修復(fù)。異體復(fù)合組織（VCA），由于取自尸體相同部位的組織，可避免以上不足，達(dá)到比較滿意的修復(fù)外形，甚至恢復(fù)部分功能，有望成為此類缺損的理想修復(fù)手段。自1998年首例手移植和2005首例臉移植成功以來，全球已進(jìn)行超過100例手移植和30多例臉移植手術(shù)，取得了較好的外觀和功能修復(fù)結(jié)果，鼓舞著后來人對異體復(fù)合組織移植的

2、探索。然而，復(fù)合組織移植面臨的主要問題是排斥和終身服用免疫抑制藥物，這對“l(fā)ife-saving”的器官移植可以接受，但對“l(fā)ife-changing”的復(fù)合組織移植無疑不可取，限制了其應(yīng)用和推廣。所以，如何減少或避免免疫抑制劑的使用成為異體復(fù)合組織移植能否進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。
　　骨髓細(xì)胞移植具有免疫耐受誘導(dǎo)作用，相關(guān)機(jī)制也得到大量研究。目前已有成功誘導(dǎo)臨床腎耐受的報(bào)道，先后在三個(gè)中心獲得成功，術(shù)后無需服用免疫抑制劑即可長期存活，

3、而且無排斥反應(yīng)發(fā)生。某些復(fù)合組織，如臉移植和手移植，本身包含血管化的骨瓣，具有骨髓和骨髓微環(huán)境，有可能作為一種更加高效的骨髓移植方式。既然移植骨髓無需經(jīng)歷骨髓加工、分離和歸巢等過程，在其原有微環(huán)境即可增殖分化，為受體持續(xù)供應(yīng)供體細(xì)胞，從而促進(jìn)耐受形成。業(yè)已證實(shí)，后肢在清髓性預(yù)處理?xiàng)l件下可自我誘導(dǎo)耐受，靈長類動(dòng)物的臉移植也因附帶骨瓣而使存活時(shí)間延長。所以，針對復(fù)合組織含血管化骨髓這一特性，本實(shí)驗(yàn)擬研究這一特殊骨髓移植方式的致耐受潛能，從而

4、試圖為復(fù)合組織致耐受，也為器官移植致耐受，開辟一個(gè)新的途徑。
　　為此，首先有必要構(gòu)建一個(gè)合適的帶血管骨髓移植模型。傳統(tǒng)的模型多以大鼠后肢為移植模型，它模擬了臨床手移植，既有利于研究移植物的免疫學(xué)特性，還可評估術(shù)后功能恢復(fù)情況。然而，該模型手術(shù)操作復(fù)雜，涉及截骨和髓內(nèi)固定，受體創(chuàng)傷大、死亡率和并發(fā)癥高。既然，我們的研究主要關(guān)注于復(fù)合組織的免疫學(xué)特性，即血管化骨髓，而對功能要求不高。因此，我們擬替代后肢，構(gòu)建一個(gè)組織成分與之類似，但

5、操作更為簡便的模型，從而有利于血管化骨髓的研究。
　　血管化骨髓不僅包含造血干細(xì)胞，還包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞，他們對移植骨髓細(xì)胞功能的發(fā)揮至關(guān)重要。大量研究證實(shí)，骨髓細(xì)胞聯(lián)合成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞甚至去骨髓的骨瓣等均可促進(jìn)骨髓植入，有利于清髓受體的造血重建及耐受誘導(dǎo)。那么這種帶血管的骨髓移植是否也像靜脈骨髓移植一樣具有造血能力？能否作為一種高效的骨髓移植方式？這都是需要研究回答的問題。
　　研

6、究血管化骨髓的最終目的是耐受，所以我們擬在非清髓性免疫誘導(dǎo)方案作用下，探索血管化骨髓的致耐受潛能。通常，骨髓誘導(dǎo)耐受有賴于受體去T細(xì)胞治療、胸腺照射和清髓性預(yù)處理，三者缺一不可，其中前兩者是為克服外周血和胸腺內(nèi)的排斥反應(yīng)，而后者是為移植骨髓“騰出空間”，提高骨髓細(xì)胞的植入率。這也是現(xiàn)有免疫誘導(dǎo)方案的基本組成部分，然而該方案涉及全身清髓，易導(dǎo)致骨髓抑制、三系細(xì)胞減少等并發(fā)癥，不適于復(fù)合組織移植。血管化骨髓同時(shí)包含骨髓和微環(huán)境，即自帶“生存

7、空間”，可能無需“騰空間”的全身清髓即可誘導(dǎo)耐受。所以，我們擬設(shè)計(jì)了一個(gè)低毒、無清髓的誘導(dǎo)方案，并基于此方案來闡明血管化骨髓的致耐受作用。
　　【目的】
　　1）構(gòu)建一個(gè)簡便、可靠的帶血管骨髓移植模型；
　　2）探索帶血管骨髓的造血重建潛能，并與傳統(tǒng)的靜脈骨髓移植進(jìn)行比較，觀察其可否作為一種有效的骨髓移植方式；
　　3）探索復(fù)合組織移植中血管化骨髓對其存活的影響，并對相關(guān)的致耐受機(jī)制進(jìn)行研究。
　　【方法】

8、
　　1）模型構(gòu)建：以股骨作為骨髓載體，在同基因的Lewis大鼠間將含腹股溝皮瓣和部分股骨的骨肌皮瓣移植到受體腹股溝區(qū)，顯微吻合供受體間的營養(yǎng)血管即股動(dòng)靜脈。術(shù)前通過解剖學(xué)研究，確定移植物的營養(yǎng)血管和基本手術(shù)步驟；術(shù)中通過美蘭灌注，觀察營養(yǎng)血管的供血分布情況；術(shù)后從組織病理學(xué)角度分析移植物的活性，驗(yàn)證該模型的可行性；最后改進(jìn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，衍生多個(gè)不同的帶血管骨髓移植模型，為后續(xù)不同實(shí)驗(yàn)的開展提供模型工具。
　　2）帶血管骨髓的造

9、血潛能評估-1：以上部分實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的股骨移植模型為骨髓載體，將GFP大鼠股骨移植給經(jīng)5Gy放射清髓的Lewis大鼠，術(shù)后給予環(huán)孢菌素A抑制排斥和GVHD（移植物抗宿主疾病），然后通過血常規(guī)、脾指數(shù)測定、骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)和組織病理等方法評估受體的造血恢復(fù)情況，并用流式、熒光顯微鏡等方法分析細(xì)胞來源。所得結(jié)果與靜脈骨髓移植組（靜注與股骨等量的骨髓細(xì)胞，陽性對照）和假手術(shù)組（陰性對照）進(jìn)行比較，評估血管化骨髓的造血潛能。
　　3）帶血管骨髓的

10、造血潛能評估-2：為避免因排斥和供體基因不純而引起的實(shí)驗(yàn)誤差，類似實(shí)驗(yàn)在同基因 Lewis大鼠中進(jìn)行重復(fù)，再次評估帶血管骨髓、靜脈骨髓細(xì)胞懸液和假手術(shù)組的造血重建情況。
　　4）帶血管骨髓致耐受性評估：以MHC完全不相符的近交系Lewis和BN大鼠作為移植供受體，所有大鼠行腹股溝皮瓣移植，同時(shí)分別聯(lián)合股骨移植（VBMT組）、靜脈骨髓移植（i.v.BMT組）和生理鹽水注射（Control組），并給予抗淋巴細(xì)胞血清、胸腺照射和環(huán)孢菌素

11、A進(jìn)行免疫誘導(dǎo)。術(shù)后對比各組皮瓣的存活時(shí)間和外周血、組織中供體特異性嵌合水平，并通過組織病理學(xué)方法評估各組皮瓣的排斥程度，組織切片和流式分析移植股骨的活性和組織來源，探索其致耐受的可能機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1）①股骨移植平均手術(shù)時(shí)間(159.0±8.3) min，其中供體剝離時(shí)間(68.0±4.8) min，缺血時(shí)間(55.8±6.8) min；
　　②美蘭灌注顯示股動(dòng)靜脈可以保證股骨和皮瓣的血供，模型具有一定的可

12、行性；
　?、鬯?0個(gè)移植物長期存活，無一例壞死，皮瓣外觀紅潤，有毛發(fā)生長；
　?、芷つw和股骨的HE染色結(jié)果基本正常，證實(shí)了模型的可行性；⑤在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展了含皮瓣的全股骨移植模型和不含皮瓣的全股骨移植模型。
　　2）①與假手術(shù)對照組相比，帶血管骨髓和靜注的骨髓細(xì)胞懸液都顯著加速了清髓大鼠白細(xì)胞和血小板的恢復(fù)（P<0.05），且恢復(fù)細(xì)胞主要來自GFP供體而非受體；
　?、趲а芄撬璐龠M(jìn)了脾集落的形成，脾

13、臟指數(shù)高于假手術(shù)組（P<0.05），脾臟HE染色雖未見結(jié)構(gòu)清晰的白髓，但可見大量淋巴小結(jié)和淋巴細(xì)胞，而假手術(shù)組脾內(nèi)細(xì)胞成分明顯減少；
　?、弁瑯?，帶血管骨髓移植組受體骨髓HE染色也可見稀疏的骨髓細(xì)胞，而對照組骨髓基本被空泡性組織所取代；單根脛骨骨髓細(xì)胞數(shù)也較對照組高一個(gè)數(shù)量級（P<0.05）；且骨髓流式和骨髓涂片顯示90％以上為 GFP+，提示移植骨髓重建受體的造血系統(tǒng)。
　?、芤浦埠?5 d切除移植股骨，恢復(fù)的白細(xì)胞和血小

14、板再次減少，進(jìn)一步驗(yàn)證了VBM在早期受體造血重建中的關(guān)鍵作用；
　?、萑欢?，以上各項(xiàng)指標(biāo)，除第5 d時(shí)VBMT組血小板數(shù)高于i.v.BMT組外，其余指標(biāo)VBMT和i.v.BMT均無明顯差異，甚至在骨髓重建上 VBMT還稍慢于i.v.BMT；
　?、扪芑撬璧耐蛞浦菜媒Y(jié)果與上述結(jié)果類似，再次驗(yàn)證了VBMT的造血潛能。
　　3）①通過抗淋巴細(xì)胞血清、胸腺照射和環(huán)孢素A聯(lián)合誘導(dǎo)，可以有效的清除受體外周血T細(xì)胞和淋巴細(xì)

15、胞，為耐受誘導(dǎo)提供了條件；
　　②在此誘導(dǎo)方案作用下，帶血管骨髓顯著延長皮瓣存活到78.8±13.0 d，而靜脈骨髓組和對照組分別在60.4±1.7 d和58.6±1.3 d發(fā)生排斥；
　?、蹘а芄撬枵T導(dǎo)了穩(wěn)定的外周血嵌合，約5.81%±1.98%，至75 d時(shí)消失，而另兩組整個(gè)觀察期幾乎無嵌合形成；
　?、軒а芄撬璐龠M(jìn)供體細(xì)胞定植到受體脾、骨髓、淋巴結(jié)，但胸腺無供體定植；
　　⑤移植股骨所含骨髓細(xì)胞逐漸被受

16、體細(xì)胞所取代，不能持續(xù)為受體供應(yīng)供體細(xì)胞；
　?、抟浦补晒莾?nèi)骨髓可能與皮瓣同時(shí)發(fā)生排斥或先于皮瓣，且最終纖維化。
　　【結(jié)論】
　　我們的研究有幾個(gè)重要發(fā)現(xiàn)：
　　1）通過股骨移植，我們成功構(gòu)建了多個(gè)簡便、可靠的帶血管骨髓移植模型，為復(fù)合組織移植中血管化骨髓的研究提供了模型基礎(chǔ)；
　　2）證實(shí)了血管化骨髓的造血作用，可以作為一種有效的骨髓移植方式，為血管化骨髓的致耐受研究提供了理論依據(jù)；
　　3）在非