角膜移植后引流淋巴結CCL19變化及其抗體延長植片存活的研究.pdf

1、第一部分:角膜移植后局部淋巴引流區(qū)的實驗研究 目的:探討大鼠角膜移植術后局部淋巴引流的主要區(qū)域。 方法:建立大鼠同種異體正位穿透性角膜移植模型，利用免疫組織化學技術檢測移植后不同時間點的同側頜下淋巴結(Submandibularlymphnodes，SMLN)、對側SMLN、同側頸淺淋巴結(Superficialcervicallymphnodes，SCLN)及對側SCLN內(nèi)樹突狀細胞(dendriticcells，DC

2、)的數(shù)量及ELISA方法檢測趨化因子CCL19的表達變化情況，同時分別摘除上述各組淋巴結，分成五組：A組：同種異體正位穿透性角膜移植；B組：同種異體正位穿透性角膜移植+同側SMLN摘除；C組：同種異體正位穿透性角膜移植+對側SMLN摘除；D組：同種異體正位穿透性角膜移植+同側SCLN摘除；E組：同種異體正位穿透性角膜移植+對側SCLN摘除，觀測各組植片存活及排斥情況。 結果:大鼠同種異體角膜移植后不同時間點內(nèi)，同側SMLN內(nèi)趨化

3、因子CCL19的表達持續(xù)增強，與之相對應的是DC細胞數(shù)量的增加(P＜0.01)，而同側SCLN及對側SMLN、SCLN內(nèi)上述各項指標均無明顯變化(P＞0.05)；正常大鼠同種異體正位穿透性角膜移植植片平均存活時間為(8.25±2.43)d，B組植片存活時間為(13.54±1.17)d，明顯延長(P＜0.01)，D組植片存活時間縮短(5.07±1.25)d，排斥反應明顯提前(P＜0.01)，而C組及E組植片存活時間無明顯影響(P＞0.05

4、)，分別為(8.36±1.96)d，(8.59±2.04)d。結論大鼠角膜移植術后頸部淋巴引流的區(qū)域主要為同側SMLN；摘除同側SMLN后植片存活時間延長，摘除同側SCLN后排斥反應提前。 第二部分:角膜移植后局部淋巴結內(nèi)CCL19表達變化及趨化活性的研究 目的:研究大鼠同種異體穿透角膜移植后同側SMLN內(nèi)趨化因子CCL19mRNA在不同時相表達的變化及淋巴結組織液對DC的趨化能力變化，探討趨化因子CCL19在角膜移植中的作

5、用。 方法:分別建立大鼠同種異體正位穿透角膜移植模型及自體原位穿透角膜移植模型，用RT-PCR法分別檢測正常角膜0d，同種異體角膜移植及自體角膜移植后1d、3d、5d、7d、10d、14d時的同側SMLN內(nèi)趨化因子CCL19mRNA的表達變化；應用免疫組織化學技術檢測兩種模型在上述時相時同側SMLN內(nèi)DC的數(shù)量變化，并用Boyden小室觀察不同時相淋巴結組織液在有和無抗CCL19抗體下對體外培養(yǎng)DC的趨化能力的變化。 結果:

6、正常淋巴結內(nèi)CCL19mRNA的表達為0.358±0.072，DC細胞為0.480±0.056；自體角膜移植術后，局部淋巴結內(nèi)CCL19mRNA的表達及DC的數(shù)量均升高，持續(xù)至術后第3d(P＜0.05)，以后逐漸恢復至正常水平(P＞0.05)，同種異體角膜移植后，局部淋巴結內(nèi)CCL19mRNA的表達及DC的數(shù)量于術后1～3d與自體移植組無顯著性差異(P＞0.05)，以后持續(xù)上升至后期顯著高于正常組及自體移植組，于7d達高峰(P＜0.01

7、)，分別為2.008±0.124和0.949±0.034，并且不同時相淋巴結組織液對體外培養(yǎng)DC的趨化作用增強(P＜0.05)，這種趨化作用可被抗CCL19抗體所阻斷(P＜0.01)，與植片排斥過程基本一致。 結論:正常淋巴結內(nèi)存在CCL19mRNA的表達和一定量的DC細胞；同種異體角膜移植后，同側SMLN內(nèi)CCL19mRNA表達持續(xù)增高，促進DC不斷遷移進入淋巴結內(nèi)進行抗原呈遞，可能是同種異體角膜移植排斥反應啟動與進展的重要因素

8、。 第三部分:角膜移植后抗CCL19抗體延長植片存活的研究 目的:觀察局部應用抗CCL19抗體對大鼠同種異體穿透角膜移植植片存活的影響作用。 方法:建立大鼠同種異體正位穿透角膜移植模型，將手術成功者分為A組、B組、C組及對照D組，均于術后立即及第術后3d、5d每只術眼每次球結膜下分別注射1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的抗CCL19抗體0.2ml，對照組(D組)球結膜下注射等量的磷酸緩沖液(PBS)，

9、對植片情況進行評分，觀察其效果，并于術后10d，免疫組織化學技術檢測同側SMLN內(nèi)DC的數(shù)量，體外單向混合淋巴細胞培養(yǎng)(mixedlymphocyteresponse，MLR)測定T細胞的增殖反應情況。 結果:各實驗組角膜植片平均存活時間分別為(9.17±2.89)d，(15.75±2.01)d，(20.19±1.88)d，對照組(8.29±2.57)d，與對照組平均存活時間相比，1μg/ml組無明顯變化(P＞0.05)，而10

10、μg/ml組、25μg/ml組則明顯延長植片存活時間(P＜0.01)，且25μg/ml組與10μg/ml組相比差異有顯著性(P＜0.01)；同側SMLN內(nèi)DC的數(shù)量在10μg/ml組、25μg/ml組明顯減少(P＜0.01)，分別為0.754±0.027和0.521±0.034，而1μg/ml組及對照組則無明顯變化(P＞0.05)，分別為0.947±0.033和0.989±0.042；MLR結果顯示：1μg/ml組及對照組淋巴結增殖明顯