與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）在大鼠急性胰腺炎中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：研究大鼠發(fā)生急性胰腺炎時(shí)，與凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)在胰腺組織的表達(dá)及其與caspase-1和IL-1β的關(guān)系；研究ASC在巨噬細(xì)胞系P388D1細(xì)胞中的表達(dá)情況，為評(píng)價(jià)ASC在大鼠急性胰腺炎時(shí)的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)將20只健康、成年的SD大鼠隨機(jī)分成兩組，一組用5％去氧膽酸鈉逆行注入大鼠胰膽管進(jìn)行急性胰腺炎造模，另一組作為正常對(duì)照組。造模24小時(shí)后處死大鼠，取大鼠新鮮血清，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大

2、鼠血清淀粉酶活性；用ELISA法測(cè)定血清IL-1β含量。取大鼠胰腺組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，做成蠟塊后連續(xù)切片，用免疫組化LAB法檢測(cè)ASC和caspase-1在胰腺組織中的表達(dá)，將染色的切片置于Olympus多功能顯微鏡觀察并攝像，應(yīng)用CA6300彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量灰度掃描，求出給定面積內(nèi)的灰度值，比較急性胰腺炎組和正常對(duì)照組間ASC和caspase-1兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)的差異。(2)制備感受態(tài)的DH5α大腸桿菌，將帶有綠色和紅色

3、熒光的質(zhì)粒pEGFP-ASC-C2和pDsRed2-ASC-C1分別轉(zhuǎn)染大腸桿菌表達(dá)，培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增，應(yīng)用大連寶生物公司生產(chǎn)的試劑盒、采用SDS堿裂解法提取和純化質(zhì)粒。(3)復(fù)蘇巨噬細(xì)胞系P388D1細(xì)胞，加入1640培養(yǎng)液約10ml混勻，分裝至兩個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。從培養(yǎng)瓶中取出300μ1細(xì)胞液加到24孔培養(yǎng)板中匯片，置37℃，5％CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在倒置顯微鏡下觀察，

4、當(dāng)細(xì)胞覆蓋至小孔底部一半時(shí)使用大連寶生物公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染試劑盒將純化的pEGFP-ASC-C2和pDsRed2-ASC-Cl質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，最后涂片后進(jìn)行熒光拍照，觀察質(zhì)粒在P388D1細(xì)胞中的表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)急性胰腺炎組血清淀粉酶水平(77632±5934nknt/L)較正常對(duì)照組水平(16303±1450nkat/L)顯著升高，兩者間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義(p<0.01)；急性胰腺炎組IL-1β

5、水平(386.26±50.54ng/L)較正常對(duì)照組水平(99.11±18.43ng/L)顯著升高，兩者間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義(p<0.01)。(2)免疫組化檢測(cè)、分析發(fā)現(xiàn)：ASC和caspase-1在正常對(duì)照組大鼠胰腺組織中少量表達(dá)，在急性胰腺炎組表達(dá)顯著增加，兩組間灰度值(24.86±523vs54.12±7.91和35.46±4.21vs65.32±8.10)的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有意義(p<0.01)。(3)在巨噬細(xì)胞系P388D