三種雙生病毒及其伴隨衛(wèi)星DNA的致病性研究.pdf

1、雙生病毒是一類世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的植物單鏈DNA病毒，已在多個國家和地區(qū)的作物上造成毀滅性災(zāi)害。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，很多單組份雙生病毒伴隨有誘導(dǎo)典型癥狀所必需的衛(wèi)星DNAβ分子。這類衛(wèi)星DNAβ分子與其輔助病毒形成了一種新型的病害復(fù)合體，給亞洲和非洲地區(qū)的農(nóng)作物生產(chǎn)造成了巨大損失。為了更好的了解雙生病毒的致病機理，本論文圍繞三種雙生病毒及其衛(wèi)星DNAβ的致病性進行了研究： l.與賽葵黃脈病毒相伴隨的衛(wèi)星DNAβ的分子變異及致病性研

2、究目前對雙生病毒伴隨的衛(wèi)星DNAβ的變異研究主要集中在來自不同寄主的衛(wèi)星DNAβ之間，本論文則對來自我國云南省不同地區(qū)賽葵上的20個與賽葵黃脈病毒(MYVV)相伴隨的衛(wèi)星DNAβ進行了克隆、測序和遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)這些衛(wèi)星DNAβ之間雖然變異較小，但是仍然具有按地理分布聚類的特征。侵染性測定表明衛(wèi)星DNAβ對于MYVV在本氏煙、心葉煙、矮牽牛和賽葵上引起典型的病害癥狀是必需的。進一步將MYVV與泰國番茄黃化曲葉病毒(TYLCTHV)DN

3、Aβ或中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)DNAβ共同接種本氏煙，發(fā)現(xiàn)MYVV可以支持異源雙生病毒的衛(wèi)星DNAβ在本氏煙中進行轉(zhuǎn)錄復(fù)制和系統(tǒng)移動，且病毒DNA在組織中的積累量與產(chǎn)生癥狀的嚴重程度呈正相關(guān)。 2.中國番茄曲葉病毒及其衛(wèi)星DNAβ的分子鑒定和致病性研究利用菜豆金色花葉病毒屬病毒的簡并引物，對從廣西省采集的表現(xiàn)出葉片下卷等癥狀的番茄樣品(G16、G17和G18)進行了PCR檢測，經(jīng)過克隆、測序發(fā)現(xiàn)這些樣品均感染了雙生

4、病毒。對所得到的部分病毒基因組序列進行聯(lián)配比較后發(fā)現(xiàn)它們具有96.6％到98.5％的序列同源性，表明它們感染了同一個雙生病毒。因此對其中的G16和G18分離物進行了病毒全基因組序列測定，發(fā)現(xiàn)G16和G18的全長分別為2729個核苷酸(AJ704602)和2733個核苷酸(AJ558119)，它們之間的序列同源性達到987％。與其它已報道的雙生病毒進行比較發(fā)現(xiàn)，G16和G18與越南番茄曲葉病毒的相似性最高，分別為83.6％和82.8％。根

5、據(jù)雙生病毒“種”的分類標準，G16和G18代表同一個雙生病毒新種的不同分離物，因此我們將這個雙生病毒新種命名為中國番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV)。系統(tǒng)進化及重組分析發(fā)現(xiàn)ToLCCNV可能是一個由重組產(chǎn)生的新病毒。進一步通過PCR的方法發(fā)現(xiàn)這些分離物中都含有衛(wèi)星DNAβ，并對其全序列也進行了測定。序列測定表明與G16、G17和G18三個分離物伴隨的DNAβ的全長分別為1346個核苷

6、酸、1341個核苷酸和1342個核苷酸(AJ704610-AJ704612)。與其它已報道的衛(wèi)星DNAβ的序列比較發(fā)現(xiàn)這三個DNAβ分子都與中國番茄黃化曲葉病毒Y8分離物的DNAβ具有最高的同源性，分別達到49.1％、49.1％和49.8％。同時，為了研究衛(wèi)星DNAβ的致病性及生物學(xué)功能，構(gòu)建了ToLCCNV-G18及其伴隨的衛(wèi)星DNAD的侵染性克隆，致病性測定發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星DNAβ是ToLCCNV誘導(dǎo)產(chǎn)生典型的病害癥狀所必需的，同時其還能提

7、高ToLCCNV在寄主植物中的積累量。 利用農(nóng)桿菌共浸潤等方法發(fā)現(xiàn)ToLCCNV DNAβ編碼的βC1蛋白為RNA沉默抑制子。同時為了明確βC1蛋白中維持RNA沉默抑制子功能的關(guān)鍵氨基酸基序，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果構(gòu)建了7個不同區(qū)段缺失的βC1突變體。農(nóng)桿菌共浸潤試驗、Northern及Western印跡雜交結(jié)果表明βC1蛋白的44-74位氨基酸構(gòu)成的中心結(jié)構(gòu)域(central domain)對于維持βC1抑制子活性是至關(guān)重要

8、的。 由于目前已報道的大多數(shù)RNA沉默抑制子也是致病因子，所以又構(gòu)建了7個βC1不同區(qū)段缺失的DNAβ的突變體的侵染性克隆。侵染性測定發(fā)現(xiàn)所有的突變體都可以在ToLCCNV的輔助下系統(tǒng)侵染本氏煙，但是均不能誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的癥狀，表明βC1蛋白的任何一段氨基酸序列都是其誘導(dǎo)產(chǎn)生典型病害癥狀所必需的。Southern印跡雜交分析發(fā)現(xiàn)雖然所有的突變體都能夠在本氏煙中復(fù)制并且各個突變體之間的復(fù)制水平以及對輔助病毒的影響不盡相同，但是總體來

9、說它們的復(fù)制水平遠遠低于野生型DNAβ的復(fù)制水平。以上實驗結(jié)果表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性并不是其誘導(dǎo)產(chǎn)生病害癥狀的決定因素。 為了確定βC1蛋白及其突變體的亞細胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡對βC1及其突變體與GFP的融合蛋白在煙草表皮細胞中的亞細胞定位進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不具備RNA沉默抑制子活性的突變體βC1 dm44-60和βC1 dm61-74也不能在細胞核中定位，而野生型及其它突變體βC1則均能在細胞核和細胞質(zhì)

10、中定位，表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性與其能否在細胞核中定位有關(guān)，其44-74位氨基酸構(gòu)成的中心結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性和在細胞核中的定位都是必需的。從ToLCCNV單獨接種或與其衛(wèi)星DNAβ共同接種的本氏煙中克隆到了11個病毒或衛(wèi)星DNAβ來源的小RNA。進一步的分析發(fā)現(xiàn)這些來源于病毒的小RNA主要集中在CP的轉(zhuǎn)錄區(qū)和βC1的轉(zhuǎn)錄區(qū)，表明病毒可能具有產(chǎn)生小RNA的熱點區(qū)。 3.泰國番茄黃化曲葉病毒是

11、一個伴隨有衛(wèi)星DNAβ的單組份雙生病毒泰國番茄黃化曲葉病毒(TYLCTHV)引起的番茄黃化曲葉病是影響泰國番茄生產(chǎn)最重要的病害之一，為了明確該病毒到底是單組份雙生病毒還是雙組份雙生病毒，構(gòu)建了TYLCTHV-Y72分離物及其伴隨的衛(wèi)星DNAβ的侵染性克隆。致病性測定表明TYLCTHV可以單獨侵染本氏煙、心葉煙和番茄并誘導(dǎo)產(chǎn)生典型的癥狀，但是當與其衛(wèi)星DNAβ共同接種時則能夠加重病害癥狀，并且可以提高病毒在植物組織中的積累量。根據(jù)以上實驗

12、結(jié)果以及之前的相關(guān)報道，我們認為TYLCTHV是一個伴隨有衛(wèi)星DNAβ的單組份雙生病毒。 4.廣西番茄曲葉病是由兩種雙生病毒及衛(wèi)星DNA復(fù)合侵染引起的通過PCR、Southern印跡、RCA-PCR以及測序等方法對采自廣西省表現(xiàn)出曲葉癥狀的31個番茄樣品進行了復(fù)合侵染檢測，發(fā)現(xiàn)雙生病毒的復(fù)合侵染是導(dǎo)致廣西省番茄曲葉病的重要原因。所有檢測的樣品中均含有ToLCCNV和中國番木瓜曲葉病毒(PaLCCNV)兩種病毒，同時還伴隨有ToL