骨膠原凝膠制備及與細(xì)胞-微球復(fù)合構(gòu)建組織工程骨的研究.pdf

1、目的：觀察大孔明膠可降解微球(CutispherG)在微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)條件下擴增人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對細(xì)胞增殖及特性的影響；檢測增強酶解法提取的豬皮質(zhì)骨膠原的生物相容性，制備其凝膠液并與細(xì)胞一微球復(fù)合構(gòu)建工程組織，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后觀察該工程組織的成骨效果。 方法：1、采用自建的“增強酶解技術(shù)”從豬骨中提取骨膠原，制備凝膠液并凍干為膠原膜，與hMSCs共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在骨膠原膜中的生長情況；植入兔體內(nèi)，觀察組織相容性及體內(nèi)降解情況；利用

2、膠原涂層β-TCP支架，觀察其對細(xì)胞上架及上架細(xì)胞的影響。2、體外分離hMSCs，擴增至第2代后分為兩組。實驗組收集1×107個細(xì)胞與預(yù)處理后的0.25gCultiSpher。G均勻混合后加入容積為50ml的高截面縱橫比容器內(nèi)，加入培養(yǎng)基及血清，在旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)行體外動態(tài)培養(yǎng)。對照組則按檢測需要的比例，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。不同時相點取材行甲基紫、MTT染色或固定后切片HE染色，觀察細(xì)胞在微球的分布情況；于培養(yǎng)后1、2、3周取樣，行掃描電

3、鏡觀察；連續(xù)2周，每天從兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞中取樣行細(xì)胞計數(shù)、MTT檢測，觀察細(xì)胞的增殖情況；在培養(yǎng)第5d和第7d分別從兩組細(xì)胞中取樣，行細(xì)胞周期和細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD29檢測，判定RCCS培養(yǎng)方式對培養(yǎng)細(xì)胞性質(zhì)有無影響。3、將擴增后的細(xì)胞-微球復(fù)合物按細(xì)胞濃度1×105/ml與冰浴狀態(tài)下的膠原凝膠液均勻混合，中性、37℃條件下凝膠液固化，完成組織構(gòu)建，同時制備單純的細(xì)胞.凝膠復(fù)合物作為對照，隨培養(yǎng)時間延長觀察兩種組織外觀及質(zhì)地變化

4、。4、利用上述凝膠固化法制備組織工程骨作為實驗組，同時以DBM為支架，常規(guī)靜止接種法構(gòu)建組織工程骨作為對照組，行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察組織中細(xì)胞形態(tài)、分布情況，并在不同時相點取材，測定DNA含量、堿性磷酸酶活性(ALP)，定量評定hMSCs增殖、成骨分化效果。 結(jié)果：1、膠原膜細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，無明顯細(xì)胞毒性表現(xiàn)，hMSCs增殖迅速，生長無受抑表現(xiàn)；2、兔體內(nèi)埋植試驗，無明顯毒性反應(yīng)，膠原膜1周時即明顯降解，2周左右完全吸收

5、；3、膠原作為β-TCP涂層材料使接種效率由46.95％提高到60.60％，且上架的細(xì)胞活性恢復(fù)迅速，增殖較未處理組快(P＜0.05)；4、RCCS培養(yǎng)，接種24h，顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞貼附于微球表面，隨培養(yǎng)時間延長細(xì)胞數(shù)量增多，并分泌大量基質(zhì)，將多個微球裹在一起；甲基紫、MTT染色提示微球上細(xì)胞隨培養(yǎng)時間延長數(shù)量逐漸增多，固定后切片HE染色可見大量細(xì)胞貼附于微球表面，并有部分細(xì)胞長入微球孔隙中；5、MTT檢測及細(xì)胞計數(shù)提示利用RCC

6、S培養(yǎng)hMSCs：對數(shù)生長期由靜止培養(yǎng)的3d延長到6d，生長高峰時收獲細(xì)胞總量由靜止培養(yǎng)獲得接種量的3.17倍增加為10.75倍；6、細(xì)胞周期檢測兩種方法無明顯差別，大部細(xì)胞處在G1期；表面標(biāo)志檢測兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞均保持了良好的干細(xì)胞特性，CD34.陰性表達(dá)，CD29陽性表達(dá)；7、骨膠原凝膠液在中性、37℃環(huán)境中約10min固化，倒置顯微鏡觀察，構(gòu)建后2h細(xì)胞從微球表面突起，24h后在凝膠中伸展，呈三維立體生長；8、大體觀察，剛構(gòu)建的

7、組織塊呈半固態(tài)膠狀，柔軟，易裂，表面光滑，隨培養(yǎng)時間延長，組織塊機械強度逐漸增強，表面開始皺縮，14d時韌如橡膠；構(gòu)建24h后，復(fù)合物體積隨細(xì)胞增殖開始縮小，14d天后對照組樣本直徑僅為原來的27.33％，而試驗組為85.33％；9、兩組復(fù)合物內(nèi)：DNA含量、ALP活性隨培養(yǎng)時間延長增加顯著，且實驗組增速快于對照組(P＜0.05)。 結(jié)論：1、增強酶解法提取的骨膠原具有良好的生物相容性和凝膠固化特性；2、CultiSpherG結(jié)