香豬睪丸microRNA鑒定及生物學(xué)功能分析.pdf

1、microRNA（miRNA）是一類重要的非編碼小RNA，在靶基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，具有明顯的階段性和組織特異性，在動(dòng)物各個(gè)發(fā)育階段的生長發(fā)育和繁殖過程中起作用。香豬作為貴州地方豬品種的優(yōu)秀代表，性成熟早，產(chǎn)仔數(shù)少，目前香豬的繁殖調(diào)控機(jī)理不完全清楚。本文采用組織學(xué)切片技術(shù)研究不同月齡香豬睪丸的顯微結(jié)構(gòu)，構(gòu)建四個(gè)月齡香豬睪丸組織小RNA cDNA文庫，通過HiSeq高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析，鑒定出香豬不同發(fā)育期miRNA

2、的表達(dá)譜，分析差異表達(dá)的miRNA分子類型和結(jié)構(gòu)，推測miRNA作用的靶基因和功能，選擇6個(gè)差異表達(dá)的miRNA，研究在不同發(fā)育時(shí)期睪丸以及其它組織的表達(dá)量變化，獲得的主要結(jié)果如下：
　　1、香豬睪丸的發(fā)育特點(diǎn)是4月齡時(shí)可檢測到成熟精子。
　　2、利用HiSeq高通量測序技術(shù)，獲得香豬2月齡、3月齡、7月齡和18月齡microRNA表達(dá)譜，每個(gè)表達(dá)譜的高質(zhì)量microRNA序列接近600萬條。
　　3、從2月齡香豬睪丸

3、RNA文庫中鑒定出254個(gè)已知miRNA和180個(gè)候選miRNA；3月齡文庫鑒定出251個(gè)已知miRNA和176個(gè)候選miRNA；7月齡文庫鑒定了227個(gè)已知miRNA和120個(gè)候選miRNA；18月齡文庫鑒定215個(gè)已知miRNA和100個(gè)候選miRNA。隨機(jī)選擇6個(gè)miRNA分子采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法證實(shí)在相應(yīng)月齡的睪丸組織中都有表達(dá)。
　　4、找到1165種miRNA在四個(gè)時(shí)期睪丸文庫中的表達(dá)量有顯著差異，其中2月齡文庫

4、中有74個(gè)miRNA的表達(dá)量顯著低于3月齡文庫；2月齡文庫miRNA的表達(dá)量顯著高于7月齡文庫和18月齡文庫，分別有219個(gè)和224個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)。3月齡文庫miRNA的表達(dá)量顯著高于7月齡文庫和18月齡文庫，分別有268個(gè)和272個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)。7月齡文庫miRNA的表達(dá)量顯著高于18月齡文庫，有21個(gè)miRNAs的表達(dá)量上調(diào)。2月齡香豬睪丸中的miRNA表達(dá)量最高，18月齡中的表達(dá)量最低。
　　5、使用

5、mirecord軟件對(duì)10種差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測，共得到1953個(gè)靶基因，經(jīng)KEGG Pathway分析，這些靶基因可能參與香豬睪丸的發(fā)育和精子的發(fā)生過程。
　　6、經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，6個(gè)miRNAs在不同發(fā)育時(shí)期的睪丸組織中均表達(dá)，總體趨勢是，隨著香豬睪丸從1月齡增加到7月齡，Let-7a-5p和miR-10的表達(dá)量先升高后下降；miR-202表達(dá)量的逐漸降低；miR-200b表達(dá)量先下降后上升；miR