TGFβ-,2-抗體抑制晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化研究.pdf

1、目的：①觀察TGFβ2和TGFβ2抗體作用于體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞(hLEC)后，對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)分化特異性標(biāo)記物αSMA和FN mRNA表達(dá)、信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad4動態(tài)表達(dá)的影響。②測定兔眼晶狀體前囊膜片囊袋內(nèi)再植入術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)房水中總量和活性TGFβ2濃度，觀察其波動規(guī)律。③活體觀察TGFβ2和TGFβ2抗體作用于兔眼晶狀體前囊膜片囊袋內(nèi)再植入術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)分化特異性標(biāo)記物αSMA和FN mRNA表達(dá)的差異。探索TGFβ2抗體

2、影響LEC轉(zhuǎn)分化的效果和機(jī)制。 方法：⑴體外培養(yǎng)的hLEC中分別添加A組10ng/ml hTGFβ2，B組0.3μg/mlTGFβ2抗體，C組10ng/ml hTGFβ2+0.3μg/mlTGFβ2抗體，對照組0.9％生理鹽水。MTT法測定對細(xì)胞增殖的影響、RT-PCR方法測定8，16，24和48h各時(shí)點(diǎn)αSMA和FN mRNA的表達(dá)，Western blot方法觀察2，8，16和24h各時(shí)點(diǎn)Smad4蛋白的表達(dá)。⑵20只新西蘭

3、白兔，一眼行晶狀體超聲乳化聯(lián)合前囊膜片囊袋內(nèi)再植入術(shù)，另一眼為對照。術(shù)后1，3，7，14和28d抽取術(shù)眼和對照眼房水樣本，ELISA法測定總量和活性TGFβ2濃度。⑶在兔眼晶狀體超聲乳化聯(lián)合前囊膜片囊袋內(nèi)再植入術(shù)后3天囊袋內(nèi)注射A組10ng/mlhTGFβ2，B組0.3μg/mlTGFβ2抗體，C組10ng/mlhTGFβ2+0.3μg/mlTGFβ2抗體，對照組平衡鹽溶液各100μl，RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定術(shù)后5、1

4、0、15d囊袋組織樣本中轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物αSMA和FN mRNA的表達(dá)量，病理組織切片HE染色法和免疫組織化學(xué)法觀察LEC、αSMA和FN蛋白的分布。 結(jié)果：①hLEC體外培養(yǎng)添加了TGFβ2和TGFβ2抗體后，MTT法檢測A組(0.154±0.006) hLEC增殖受到抑制，與對照組(0.191±0.008)相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)；B組(0.203±0.014)和C組(0.202±0.008) hLEC增殖未受到抑

5、制，與對照組(0.191±0.008)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。RT-PCR法檢測A組8h即可出現(xiàn)αSMA和FN mRNA表達(dá)并持續(xù)至48h，B組和對照組48h出現(xiàn)αSMA和FN mRNA表達(dá)陽性，C組24h和48h出現(xiàn)αSMA和FN mRNA表達(dá)陽性。Western blot法檢測A組各時(shí)間點(diǎn)均可檢測到Smad4蛋白，2h有表達(dá)(1.51g/L)，16h達(dá)到峰值(3.15g/L)。對照組、B組和C組在2h和8h Smad4

6、蛋白相對含量較低。②ELISA法測定兔眼術(shù)后房水樣本發(fā)現(xiàn)術(shù)后1d房水中總量TGFβ2濃度升高，維持較高水平超過術(shù)后28d；活性TGFβ2濃度術(shù)后1、3d下降，術(shù)后7d恢復(fù)至術(shù)前水平。③RT-PCR法檢測，各組術(shù)后5d即可出現(xiàn)αSMA表達(dá)陽性，持續(xù)至術(shù)后15d。A組術(shù)后5d出現(xiàn)FN mRNA表達(dá)，持續(xù)至術(shù)后15d，B組、C組和對照組術(shù)后10和15d出現(xiàn)FN mRNA表達(dá)陽性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，術(shù)后5dA組(4.339±0.196)α

7、SMA mRNA表達(dá)明顯高于對照組(2.043±0.159)(P<0.05)，B組(0.797±0.023)和C組(1.214±0.121)αSMA mRNA表達(dá)明顯低于對照組(2.043±0.159)(P<0.05)。術(shù)后10d A組(1.941±0.220)αSMA mRNA表達(dá)量明顯高于對照組(1.494±0.054)(P<0.05)。B組(1.108±0.257)和C組(1.373±0.163)αSMA mRNA表達(dá)量與對照組(

8、1.494±0.054)無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。病理組織切片HE染色術(shù)后1d前囊膜LEC增殖，后囊膜未見LEC附著。術(shù)后3d后囊膜見LEC移行、附著。免疫組織化學(xué)法檢測術(shù)后5d A組和B組囊膜間隙LECαSMA染色陽性。 結(jié)論：兔眼晶狀體前囊膜片再植入術(shù)后房水中總量TGFβ2濃度升高，維持高水平超過28d；活性TGFβ2濃度降低，至術(shù)后7d恢復(fù)到術(shù)前水平。TGFβ2抗體可以對抗TGFβ2抑制LEC增殖的作用，減少通用型