魚類諾達(dá)病毒對(duì)軍曹魚的致病性及其重組疫苗的研究.pdf

1、魚類諾達(dá)病毒(piscine nodavirus)是多種養(yǎng)殖魚類的重要病原，給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失。 本文以赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV,Redspotted grouper-nervour necrosis virus)為研究對(duì)象，通過(guò)肌肉注射、浸泡和和共浴三種感染途徑研究了魚類諾達(dá)病毒對(duì)軍曹魚(Rachycentron canadum)仔魚(平均體重約3.6g)的致病性。結(jié)果表明，三種方法都能導(dǎo)致軍曹魚仔魚發(fā)病，病魚臨

2、床癥狀典型，如食欲減退、活動(dòng)力下降、體色發(fā)黑、部分魚做螺旋狀或亢奮游動(dòng)等。肌肉注射組、浸泡組和共浴組的累計(jì)死亡率分別為78％、44％和32％。采用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)在患病魚的腦、眼、脊髓中均能檢測(cè)到諾達(dá)病毒，而在其它器官(鰓、腸、肝、脾、腎和肌肉)沒有檢測(cè)到，在肌肉注射組中檢出病毒的時(shí)間最早、檢出率最高；在共浴感染組和浸泡組檢測(cè)到病毒的時(shí)間較晚，檢出率較低。然而，在無(wú)臨床癥狀的幸存?zhèn)€體中也檢測(cè)到該病毒的存在。

3、 本文還根據(jù)RGNNV的RNA2的ORF核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出了RGNNV的主衣殼蛋白(MCP)基因。擴(kuò)增片段長(zhǎng)為1017bp，編碼338個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量約為37kD。將RGNNVD的MCP基因連接到表達(dá)載體pRSET A質(zhì)粒中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pRSET A-MCP，經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序等方法驗(yàn)證了目的基因連接的正確性。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS進(jìn)行融合表達(dá)，所

4、得融合蛋白分子量約為44.5kD。通過(guò)在不同培養(yǎng)基、不同溫度和不同pH的條件誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步優(yōu)化了表達(dá)條件，結(jié)果該重組菌在SOB和LB培養(yǎng)基，pH7.0，37℃條件下表達(dá)量較高，表達(dá)的融合蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在，提取的包涵中融合蛋白含量占60％以上，經(jīng)柱層析純化蛋白，純化度達(dá)90％以上。采取親和層析和SDS-PAGE割膠兩種方式對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化，分別將兩種方式純化的融合蛋白做抗原來(lái)免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。

5、將重組BL21/pRSETA-MCP表達(dá)的融合蛋白制備成疫苗，腹腔注射免疫軍曹幼魚(重約8.6g)。免疫分為一次免疫組(A)、三次免疫組(B)和對(duì)照組(C)。在A組和B組中按照分別免疫10μ/尾、50μ/尾、100μg/的劑量依次分為A1、A2、A3組和B1、B2、B3組(每組25尾實(shí)驗(yàn)魚)。A組的死亡率和發(fā)病率均比對(duì)照組C低。其中A2組的相對(duì)存活率和相對(duì)保護(hù)率分別為31％和28％，三次免疫組B的死亡率比和發(fā)病率也均比對(duì)照組C低。B2組

6、的相對(duì)存活率和相對(duì)保護(hù)率分別高達(dá)54％和56％。B2組和C組，累計(jì)死亡率呈現(xiàn)極顯著差異，P＜0.01，B2組和C組發(fā)病率呈現(xiàn)顯著差異，P＜0.04。兩個(gè)免疫組間比較，三次免疫組B的死亡率和發(fā)病率均比一次免疫組A低。而且對(duì)于免疫的劑量而言，也存在差異，免疫注射劑量并不是量越大越好，注射50μg/尾的B2組的免疫效果明顯好過(guò)10μg/尾的B1和100μg/尾的B3組?；疾∷劳鰝€(gè)體中檢測(cè)的陽(yáng)性率各組均為100％，在幸存?zhèn)€體的檢測(cè)中B2組的陽(yáng)性