感染人的新型梨形蟲病原體的動(dòng)物感染,形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定.pdf

1、梨形蟲(Piroplasma)屬頂復(fù)門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoa)、梨形蟲目(Piroplasmida),對(duì)人畜健康影響較大的蜱傳種類分別屬于巴貝蟲屬(Babesia spp.)和泰勒蟲屬(Thelieria spp.),可引起梨形蟲病[1],由于過(guò)去梨形蟲曾譯為“焦蟲”,故梨形蟲病又被稱為“焦蟲病”,也曾稱“紅細(xì)胞住血原蟲(hematocytozoon)”[2]。
　　 梨形蟲經(jīng)由蜱傳播,在宿主體內(nèi)

2、的主要形態(tài)呈圓形、梨形、桿形、橢圓形、逗點(diǎn)形或阿米巴形等形態(tài),具有頂復(fù)細(xì)胞器。有性生殖和孢子增殖是在無(wú)脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)進(jìn)行,在脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)進(jìn)行無(wú)性生殖。梨形蟲病一般呈急性過(guò)程,通常表現(xiàn)為貧血、血紅蛋白尿和黃疸,具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性,巴貝蟲是人和動(dòng)物巴貝蟲病的病原,而泰勒蟲是動(dòng)物泰勒蟲病的病原[3-6]。一般認(rèn)為,泰勒蟲不感染人類。梨形蟲病在世界各地流行,死亡率高,給畜牧業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成重大損失[1]。
　　 梨形蟲的鑒定

3、與分類主要有傳統(tǒng)分類學(xué)和分子分類學(xué)兩種方法[7]。傳統(tǒng)分類學(xué)依據(jù)所寄生的宿主、形態(tài)、發(fā)病動(dòng)物臨床癥狀等進(jìn)行分類,但由于病原形態(tài)的多變性,生活史較難追蹤,傳播媒介多樣性,種種因素使傳統(tǒng)分類學(xué)存在一定的局限[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,核酸擴(kuò)增方法在梨形蟲的分類鑒定有著決定性的作用。
　　 本研究將取自有臨床癥狀的病人帶蟲血液分別對(duì)四種動(dòng)物(昆明鼠,Balb/c小鼠,沙鼠,新西蘭兔)進(jìn)行感染,感染后定期取血觀察血液內(nèi)病原體的形態(tài)

4、特征,并觀察超微結(jié)構(gòu),從形態(tài)學(xué)上對(duì)該梨形蟲進(jìn)行鑒定。在該梨形蟲在動(dòng)物體內(nèi)的感染量達(dá)到峰值的時(shí)候,取動(dòng)物血液提取DNA,擴(kuò)增梨形蟲18S rRNA,對(duì)該梨形蟲進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。
　　 在動(dòng)物血液涂片的觀察中發(fā)現(xiàn),該梨形蟲在白細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核周圍呈密集的點(diǎn)狀,類似嗜堿性白細(xì)胞。在紅細(xì)胞中可以觀察到梨形、橢圓形、逗點(diǎn)狀的外觀形態(tài)。與巴貝蟲和泰勒蟲的形態(tài)[9,10]對(duì)比有相似之處,具有泰勒蟲的特征,即白細(xì)胞內(nèi)裂體增殖,提示該病原體有可能是

5、泰勒蟲相關(guān)種類。
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,合成四條針對(duì)巴貝蟲、泰勒蟲18S rRNA的通用引物進(jìn)行半巢式多重PCR,三次PCR擴(kuò)增的片段均與泰勒蟲具有更高的同源性,對(duì)PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序364bp序列比對(duì),與泰勒蟲18S rRNA同源性達(dá)到99％。
　　 但是,在多次重復(fù)的PCR中,也出現(xiàn)克隆序列與Colpodella序列84％同源性。而我國(guó)學(xué)者也在發(fā)熱病人血液中擴(kuò)增到Colpodella相似序列,Colpodella是一種

6、與其它頂復(fù)門原蟲(包括瘧原蟲及梨形蟲)具有并列進(jìn)化關(guān)系的自由生活原蟲[11]。
　　 本研究所鑒定梨形蟲取自病人血液,通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合,從動(dòng)物外周血白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)裂殖體,提示該蟲具有泰勒蟲的形態(tài)特征。綜合多次PCR及測(cè)序結(jié)果,擴(kuò)增序列與泰勒蟲和Colpodella的相似程度高于巴貝蟲,說(shuō)明該病原體是巴貝蟲的可能性小于前兩種蟲。迄今為止,寄生蟲學(xué)研究認(rèn)為,巴貝蟲可以感染人和動(dòng)物,泰勒蟲僅在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn),但從NC

7、BI的GenBank中搜索到一個(gè)泰勒蟲的序列是從發(fā)熱病人血液擴(kuò)增得到的[12];Colpodella相似的序列也有從人體擴(kuò)增的報(bào)道。這種現(xiàn)象尚難以解釋,不能確定是幾種病原體的混合感染,還是一種尚待認(rèn)知的新蟲種。泰勒蟲和巴貝蟲屬于頂體復(fù)合物門,而Colpodellids門則是與頂體復(fù)合物門相近的一個(gè)姊妹世系(sister lineage),因而,該病原體的分類地位可能在囊泡蟲總門(Alveolata)。其確切的分類地位有待進(jìn)一步鑒定。