miR-497在肝癌血管生成與轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌（主要是肝細(xì)胞癌）是全球第二大致死性癌癥，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，全球每年有750，000例新發(fā)病例。目前手術(shù)切除是針對(duì)早期肝癌最行之有效的治療手段。但因肝癌起病隱匿，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屆晚期，喪失手術(shù)治療時(shí)機(jī)。傳統(tǒng)化療藥物如阿霉素、順鉑等，雖有強(qiáng)勁抗癌效果，但因副作用大、腫瘤靶向性差等原因從而限制了其在肝癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。肝癌患者結(jié)局如此凄涼的主要原因還在于我們對(duì)其發(fā)病的分子機(jī)制仍知之甚少，無(wú)法實(shí)施靶向治療。因此，探索

2、肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子事件，闡明其具體機(jī)制并開發(fā)有效治療方式是一項(xiàng)十分緊迫的課題。HCC是血管富集的實(shí)體瘤，活躍的血管生成能力和頻發(fā)的轉(zhuǎn)移是肝癌發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中的兩大特征，因此抑制肝癌的血管生成和轉(zhuǎn)移的發(fā)生有望阻斷肝癌的進(jìn)展，成為肝癌治療的突破口。MicroRNAs(miRNAs)是一組保守的非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn) miRNA表達(dá)水平的改變參與多種腫瘤發(fā)生的重要生物學(xué)過(guò)程。我們前期應(yīng)用表達(dá)譜芯片篩選了肝癌

3、細(xì)胞細(xì)胞株與原代正常肝細(xì)胞差異性表達(dá)的miRNA，其中miR-497在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)低于原代正常肝細(xì)胞。本研究擬進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-497的差異性表達(dá)并系統(tǒng)研究其在肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的功能及作用靶點(diǎn)。
　　方法：運(yùn)用SYBR Green qRT-PCR方法鑒定36對(duì)肝癌和癌旁組織中miR-497的表達(dá)情況，并比較8株肝癌細(xì)胞株和2株正常肝細(xì)胞株中miR-497的表達(dá)差異。通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞募集實(shí)驗(yàn)、小管生成實(shí)驗(yàn)、trans

4、well遷移侵襲實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探索miR-497的異常表達(dá)在肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移中的作用。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站如miRBase、miRNA.ORG、PicTar、TargetScan等數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miR-497的靶基因，從中篩選與血管生成及轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因。繼而采用SYBR Green qRT-PCR、Western Blot、ELISA以及Luciferase精確靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證miR-497對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的作用靶點(diǎn)，闡明其作用機(jī)制。

5、最后，我們利用肝癌裸鼠皮下移植瘤模型和尾靜脈注射肝癌細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)移瘤模型的方法，驗(yàn)證miR-497在裸鼠體內(nèi)對(duì)肝癌生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移的作用。
　　結(jié)果：miR-497在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，與此一致，miR-497在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)也普遍低于正常肝細(xì)胞株。上調(diào)肝癌細(xì)胞中 miR-497的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC的募集能力和促小管形成能力，并能抑制肝癌細(xì)胞自身的遷移侵襲能力。miR-497可

6、直接作用于血管內(nèi)皮因子VEGFA和星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因AEG-1的3’-UTR序列從而發(fā)揮抑制肝癌血管生成和轉(zhuǎn)移的能力。慢病毒介導(dǎo)的 miR-497可明顯降低肝癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力、瘤內(nèi)血管生成能力和血液中肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：我們的研究闡明了miR-497通過(guò)直接抑制靶基因VEGFA和AEG-1從而抑制肝癌的血管生成和轉(zhuǎn)移能力，揭示了 miR-497在肝癌發(fā)生中的部分作用和分子機(jī)制，為miR-497及其靶基因作為肝