TK-1和TIMP-1基因共表達抑制大鼠球囊拉傷后頸動脈內(nèi)膜增生的實驗研究.pdf

1、目的：
　　將介導(dǎo)人的TK-1和TIMP-1基因共表達重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠頸總動脈球囊拉傷后血管內(nèi)膜增生模型，觀察并比較單基因（Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1）載體或雙基因共表達載體（Ad-hTK-1-hTIMP-1）對拉傷后血管內(nèi)膜增生的影響及可能機制。
　　方法：
　　應(yīng)用經(jīng)典的球囊拉傷法，建立SD大鼠左頸總動脈拉傷后血管內(nèi)膜增生動物模型，取250-350g雄性SD大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組，單純拉傷組，

2、對照病毒組，Ad-hTK-1組，Ad-hTIMP-1組，雙基因（Ad-hTK-1和Ad-hTIMP-1）組。除假手術(shù)組外，其余各組用2F球囊導(dǎo)管從頸外動脈進入頸總動脈并拉傷，分別在各組大鼠拉傷頸動脈處注射生理鹽水（30μl）、對照病毒、Ad-hTK-1、Ad-hTIMP-1或雙基因病毒(1×109pfu/只,在30μl病毒保存液里)。局部干預(yù)14天后處死大鼠，組織學檢測內(nèi)膜增生情況（計算內(nèi)膜/中膜面積比），共聚焦免疫熒光檢測 hTK-1

3、、hTIMP-1基因的表達，蛋白免疫印跡法檢測hTK-1、hTIMP-1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平，免疫組化檢測PCNA表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立球囊拉傷大鼠頸總動脈的血管內(nèi)膜增生動物模型（第一部分），球囊拉傷后7、14、28 d內(nèi)膜面積（IA）和內(nèi)膜/中膜面積比值（I/M）逐漸增大（趨勢檢驗P＜0.01）；各實驗組IA、I/M呈時間依賴性（7-28 d）增加（P＜0.01）。
　　2.與假手

4、術(shù)組相比，單純拉傷頸總動脈或?qū)φ詹《窘M大鼠的內(nèi)膜面積（IA）和內(nèi)膜/中膜面積比值(I/M)明顯增加（P均＜0.01）。單純拉傷組和對照病毒組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對照病毒干預(yù)大鼠相比，Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1或雙基因局部干預(yù)14d后，均可明顯減少拉傷后大鼠頸總動脈IA（0.110±0.015比0.160±0.010；0.121±0.016比0.160±0.010；0.081±0.008比0.160±0.01

5、0；P均＜0.01）和I/M比值（1.443±0.097比2.035±0.117；1.522±0.078比2.035±0.117；0.972±0.072比2.035±0.117；均P＜0.01），明顯抑制新生內(nèi)膜增厚，抑制率分別為29.1％，25.2%和52.2%。與Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1單基因比較，雙基因聯(lián)合共表達可進一步降低IA和I/M比值（P均＜0.01），減輕內(nèi)膜增生。
　　3.球囊拉傷后頸動脈損傷部位的P

6、CNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組（均 P＜0.01）。單純拉傷組與對照病毒組相比，PCNA、MMP-2和MMP-9水平均差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1或雙基因干預(yù)后，均能顯著下調(diào)PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平（均P＜0.01）。與Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1單基因比較，雙基因聯(lián)合共表達可進一步降低PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平（均

7、P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建大鼠頸總動脈球囊拉傷后血管內(nèi)膜增生模型，局部應(yīng)用攜帶的目的基因 TK-1和（或）TIMP-1的重組腺病毒載體，可將目的基因成功轉(zhuǎn)入頸總動脈，并獲得有效表達。
　　2.TK-1或TIMP-1單基因過表達均可抑制球囊拉傷后內(nèi)膜增生，與單基因（TK-1或TIMP-1）表達載體相比，同一載體介導(dǎo)的雙基因（TK-1和TIMP-1）聯(lián)合共表達抑制球囊拉傷后的大鼠頸動脈內(nèi)膜增生具有疊加效