大腸桿菌噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17的表達(dá)、抗菌效應(yīng)分析及優(yōu)化設(shè)計(jì)預(yù)測(cè).pdf

1、自噬菌體被發(fā)現(xiàn)以來便廣發(fā)被用于抗菌相關(guān)研究。但是自弗萊明于1928年意外發(fā)現(xiàn)青霉素作為抗菌藥物以后,由于抗生素治療效果顯著,且噬菌體研究不夠成熟,利用噬菌體進(jìn)行抗菌一直處于擱置狀態(tài)。2001年Nelson等通過重組表達(dá)獲得了純化的噬菌體裂解酶并將其作為抗菌物質(zhì)進(jìn)行研究。近年來,隨著耐藥菌的廣泛產(chǎn)生以及環(huán)境保護(hù)面臨嚴(yán)峻壓力,以及抗生素的研發(fā)周期遠(yuǎn)長(zhǎng)于細(xì)菌對(duì)該物質(zhì)產(chǎn)生耐藥的周期,對(duì)噬菌體抗菌功能的探索及應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)逐漸成為醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)之一

2、。噬菌體的天然抗菌效應(yīng)和通過分子生物學(xué)技術(shù)人工修飾的改良產(chǎn)物表現(xiàn)特色給環(huán)境凈化、水體凈化、食物安全及臨床抗菌應(yīng)用開辟了新的發(fā)展方向。2013年歐洲還成立了PhagoBurn項(xiàng)目專門用于研究噬菌體治療燒傷后大腸桿菌和綠膿桿菌感染問題。
　　噬菌體作為細(xì)菌病毒,能夠特異性識(shí)別和裂解細(xì)菌,其滅菌效應(yīng)被越來越多的研究者關(guān)注。噬菌體裂解酶作為噬菌體在進(jìn)入細(xì)菌之前溶解細(xì)胞壁以及在宿主體內(nèi)繁殖之后裂解細(xì)菌、釋放子代噬菌體的關(guān)鍵酶,現(xiàn)正受到越來越

3、多的研究者的重視并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　本教研室在醫(yī)院的污水池中分離到一株大腸桿菌噬菌體并將其命名為L(zhǎng)SB-1,初步研究發(fā)現(xiàn)了該噬菌體裂解細(xì)菌的相關(guān)酶基因gp17,并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序后提交至GenBank(GenBank序列號(hào):KC425724.1)。本研究通過原核表達(dá)技術(shù)將唾液酸酶基因克隆到質(zhì)粒pET300構(gòu)建重組質(zhì)粒pET300-gp17,然后再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,最

4、終獲得了gp17基因表達(dá)的純化蛋白。采用KB紙片法對(duì)純化重組蛋白的有效菌譜進(jìn)行測(cè)定,并將測(cè)定結(jié)果與通過噬菌體展示技術(shù)將gp17基因重組到T7噬菌體得到的T7-LSB-gp17重組噬菌體的有效菌譜進(jìn)行比較,并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步提高酶活性,擬對(duì)gp17唾液酸酶的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變以增強(qiáng)其活性,并用AutoDock分子對(duì)接軟件對(duì)替換后的蛋白和唾液酸進(jìn)行對(duì)接以查看替換后蛋白和唾液酸的結(jié)合效果。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.唾液酸

5、酶基因的克隆、表達(dá)和純化:利用基因重組技術(shù)將EIEC8401噬菌體LSB-1裂解酶基因gp17構(gòu)建到表達(dá)載體質(zhì)粒pET300中,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)及純化,最終獲得了gp17基因通過重組成功表達(dá)出分子量為78kDa的溶解蛋白;利用BCA法測(cè)定純化重組蛋白的含量,純化后濃度為2.38mg/ml。
　　2.利用抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白的抑菌活性:以大腸桿菌、葡萄球菌等多種細(xì)菌等為試驗(yàn)菌采用Kirby-Bauer紙片法對(duì)

6、重組噬菌體唾液酸酶的有效作用菌譜進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)重組噬菌體酶對(duì)噬菌體宿主菌EIEC8401有良好的抑菌作用,經(jīng)過5小時(shí)的培養(yǎng)能夠見到直徑約為2cm、明顯的抑菌圈,對(duì)其他種類的細(xì)菌無明顯抑菌作用,顯示該噬菌體酶具有高度特異性,這種特異性與T7噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)物(重組噬菌體T7-LSB-gp17較寬的宿主譜)不同。
　　3.采用結(jié)構(gòu)域單獨(dú)表達(dá)法與非保守位點(diǎn)突變法為理論依據(jù)設(shè)計(jì)突變體,通過AutoDock軟件分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)將結(jié)構(gòu)域直接進(jìn)行

7、表達(dá)(突變體2)以及非保守位點(diǎn)124位(突變體6)和167位(突變體7)的天冬酰胺改變?yōu)榻z氨酸獲得的突變體進(jìn)行表達(dá)獲得突變體具有結(jié)合能更低、與底物結(jié)合能力更強(qiáng)。用信息技術(shù)對(duì)突變體進(jìn)行顯示了生物信息學(xué)差異。
　　綜上所述,本研究將噬菌體裂解細(xì)菌的唾液酸酶進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化獲得目的蛋白,進(jìn)行體外活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)EIEC8401有較好的特異性,其結(jié)果與通過噬菌體展示技術(shù)獲得的重組噬菌體T7-LSB-gp17有較大的差異;通過對(duì)酶的相關(guān)