單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌溶血素基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(Listeria Monocytogenes,LMO)是李斯特氏菌屬的重要成員,屬于細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽(yáng)性桿菌.該菌在病原學(xué)上作為一種重要的人畜共患和食源性疾病的病原菌在公共衛(wèi)生學(xué)上有重要意義,近幾年已在許多國(guó)家報(bào)道由LMO引起的李斯特氏菌病及食物中毒.本菌可致人和動(dòng)物患腦膜炎、敗血癥、腦膜腦炎、流產(chǎn)等,發(fā)病率雖低,但死亡率高達(dá)30﹪~70﹪.Hemolysin(hly)基因是LMO的毒力標(biāo)志基因,屬于巰基活化

2、的結(jié)合膽固醇的細(xì)胞溶血素家族,是LMO必要的致病因子.該實(shí)驗(yàn)根據(jù)GeneBank已發(fā)表的LMO hly完整基因序列,設(shè)計(jì)并合成分別帶有SalI和XbaI酶切位點(diǎn)的上下游引物TU、TL,以LMO 0586株總DNA為模板,應(yīng)用PCR技術(shù),擴(kuò)增得到hly全基因.將純化的該基因片段克隆到pMD18-T載體中,通過(guò)單雙酶切及PCR鑒定篩選帶有插入片段的陽(yáng)性重組質(zhì)粒,命名為pMD18-T-hly.對(duì)克隆的hly基因進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果顯示LMO

3、 0586 hly基因全長(zhǎng)1646bp,含有完整的開(kāi)放閱讀框架,編碼529個(gè)氨基酸.運(yùn)用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與國(guó)外報(bào)道的LMO F6789株、LMO F2365株進(jìn)行同源比較,結(jié)果顯示,核苷酸序列同源性分別為99.70﹪和99.39﹪.推導(dǎo)出的氨基酸序列與其相應(yīng)菌株比較,同源性分別為99.82﹪和98.90﹪.以重組質(zhì)粒pMD18-T-hly為模板,重新設(shè)計(jì)并合成分別含有BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)的上下游引物PU、PL,通過(guò)PC

4、R擴(kuò)增hly基因,然后將其定向克隆到原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-1的BamHI與XhoI之間,命名為pGEX-6P-hly.將鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE<,3>)中.挑選含重組質(zhì)粒的菌落,經(jīng)IPTG(1.0mmol/L)誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE分析,目的蛋白與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST大小約為26ku)融合后的重組蛋白大小約為72ku.光密度掃描對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步定量表明,72ku融合蛋白占菌體總蛋白的