人谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選及Rhein改善胰島素抵抗和脂代謝紊亂作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、己糖胺通路(Hexosamine biosymthesis pathway,HBP)是葡萄糖代謝的途徑之一,其關(guān)鍵酶是谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶(Glutamine:fructose-6-phosphateamidotransferase,GFAT),終產(chǎn)物是二磷酸尿嘧啶-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)。近年來研究發(fā)現(xiàn)該通路作為機(jī)體的能量感受器,在胰島素抵抗、脂代謝紊亂、糖尿病及其血管并發(fā)癥等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作

2、用。己糖胺通路的流量增加及O-GlcNAc的水平升高,與胰島素抵抗及其相關(guān)代謝性疾病的代謝紊亂密切相關(guān)。對(duì)己糖胺通路的研究,將為探討代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制及治療途徑提供新的線索。本論文分三個(gè)部分展開。
　　 一、人谷氨酰胺-6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶(hGFAT)抑制劑的篩選
　　 從人肝組織的cDNA中擴(kuò)增出hGFAT1基因全長(zhǎng)片段,構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET32b-GFAT,在大腸桿菌Origami(DE3)中表達(dá)了hG

3、FAT蛋白。通過鎳離子螯合柱(Ni-NTA)親和層析柱,獲得了純度較高的hGFAT蛋白。使用GDH法檢測(cè)了重組hGFAT蛋白的催化活性,并初步探討了GFAT的酶動(dòng)力學(xué)特性。利用重組hGFAT蛋白,建立了GFAT抑制劑體外篩選方法。并篩選天然產(chǎn)物和化學(xué)合成樣品300多樣次,發(fā)現(xiàn)大黃酸(Rhein)對(duì)GFAT的抑制作用。
　　 通過生物信息學(xué)分析hGFAT的抗原性和屬間同源性,選擇人和小鼠相同的基因區(qū)域；擴(kuò)增小鼠肝臟cDNA中GFA

4、T基因片段,構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET28b-GFAT。在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了Ab-hGFAT蛋白,用Ni-NTA純化了重組Ab-hGFAT,免疫BALB/c小鼠,得到特異性較高的抗hGFAT多克隆抗體。并觀察了T型糖尿病小鼠模型和胰島素抵抗小鼠模型各組織GFAT的表達(dá)情況。Rhein可降低胰島素抵抗小鼠骨骼肌組織中GFAT的表達(dá)。
　　 成功將hGFAT基因轉(zhuǎn)入胰島素受體多表達(dá)的HIRc細(xì)胞,建立了hGFAT高

5、表達(dá)的hGFAT-HIRc細(xì)胞模型。與HIRc細(xì)胞比較,hGFAT-HIRc細(xì)胞GFAT的蛋白水平、mRNA水平及活性均有所升高;其形態(tài)無明顯變化,細(xì)胞周期改變不明顯；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入基因的細(xì)胞對(duì)GFAT抑制劑的敏感性略有增加。胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞葡萄糖攝取能力明顯降低；胰島素刺激下的細(xì)胞內(nèi)O-糖基化水平升高；胰島素刺激下Akt的磷酸化水平降低,Akt的O-糖基化水平升高。Rhein對(duì)hGFAT-HIRc的細(xì)胞周期無明顯影響,但可降

6、低GFAT的活性,抑制細(xì)胞總體的O-糖基化水平。Rhein還可改善hGFAT-HIRc細(xì)胞的胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取能力,升高Akt的Ser473位磷酸化水平,并降低Akt的O-糖基化水平。
　　 二、Rhein改善胰島素抵抗的藥理作用及機(jī)制研究
　　 Rhein具有明顯的GFAT抑制作用,降低高脂飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠(HFD)升高的GFAT活性及蛋白表達(dá),降低其肌肉中O-糖基化水平。
　　 GFAT抑制劑Rh

7、ein可呈劑量依賴性地提高機(jī)體的胰島素敏感性,降低HFD小鼠血清中胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù),改善葡萄糖耐受能力和胰島素耐受能力,增加正糖鉗實(shí)驗(yàn)中機(jī)體整體的胰島素依賴的葡萄糖代謝能力和肝臟、骨骼肌、脂肪等胰島素靶組織的胰島素依賴的葡萄糖攝取能力。Rhein對(duì)HFD小鼠的胰島素增敏作用,可能與增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路中胰島素誘導(dǎo)的IR-β和IRS-1的酪氨酸磷酸化水平、提高Akt和GSK3β的磷酸化水平、以及增加肌肉中GLUT4向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)位

8、等調(diào)節(jié)作用相關(guān)。
　　 Rhein可促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞和C2C12成肌細(xì)胞的葡萄糖消耗,且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。對(duì)高糖高胰島素誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗的IR-3T3-L1細(xì)胞模型和IR-C2C12肌細(xì)胞模型,Rhein可明顯增強(qiáng)其胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取能力、提高胰島素刺激下GLUT4向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)位及p-Akt(Ser473)的表達(dá)。
　　 三、Rhein改善脂質(zhì)代謝的藥理作用及機(jī)制研究
　　 GFAT抑制劑

9、Rhein對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞增殖和分化均具有抑制作用,與抑制3T3-L1細(xì)胞分化相關(guān)的PPARγ和C/EBPα蛋白及mRNA水平有關(guān)。Rhein還可降低高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重、白色脂肪重量和脂肪指數(shù),并抑制其白色脂肪組織中與脂肪生成相關(guān)的基因表達(dá)。
　　 Rhein可改善HFD小鼠非酒精性脂肪肝病,降低肝指數(shù)、血清ALT水平和肝脂的堆積；降低血清TC水平。抑制肝臟中脂質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子PPARγ及其轉(zhuǎn)錄激活因子PGC

10、-1α、抑制脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶-FAS和SCD-1、抑制脂質(zhì)生成相關(guān)基因ACCα、ap2和UCP2的mRNA水平,可能是Rhein改善HFD小鼠的肝臟脂代謝紊亂的主要作用機(jī)制。
　　 Rhein可降低HFD小鼠骨骼肌中甘油三酯含量。降低骨骼肌中CD36和FATP1的mRNA水平、增加CPT1的mRNA水平、增加AMPK的絲氨酸磷酸化水平,從而減少肌肉細(xì)胞脂肪酸吸收和促進(jìn)脂肪酸在線粒體的氧化,可能是Rhein改善骨骼肌脂質(zhì)異位

11、堆積的主要作用機(jī)制。
　　 總之,本論文首先采用原核表達(dá)體系獲得重組的人GFAT蛋白,并建立了GFAT抑制劑的體外篩選方法:在篩選中發(fā)現(xiàn)了Rhein對(duì)GFAT的抑制作用。分別通過體外高表達(dá)GFAT的細(xì)胞模型、1型糖尿病及胰島素抵抗的動(dòng)物模型,證明了Rhein對(duì)GFAT的抑制作用。其次,分別在高脂飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗的動(dòng)物模型和高糖高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗的細(xì)胞模型上,觀察到Rhein改善胰島素抵抗的藥理作用并探討了其作用機(jī)制。最

12、后,在3T3-L1脂肪細(xì)胞模型上觀察到Rhein抑制脂肪細(xì)胞分化的作用；并通過抑制白色脂肪組織中與脂肪生成相關(guān)的基因表達(dá),減輕高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重:通過抑制肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)因子,改善HFD小鼠非酒精性脂肪肝病；并通過減少肌肉細(xì)胞脂肪酸吸收和促進(jìn)脂肪酸在線粒體的氧化,改善骨骼肌的脂質(zhì)異位堆積。
　　 本論文以GFAT作為胰島素增敏的新靶點(diǎn),從尋找高效高選擇性的GFAT抑制劑出發(fā),為胰島素抵抗合并脂代謝紊亂防治開辟了新的途