急性髓系白血病TFPI-2基因表達及啟動子甲基化的研究.pdf

1、背景：近年來研究表明，DNA甲基化尤其是抑癌基因的高甲基化所致失表達在白血病的發(fā)生、發(fā)展、診斷及其預后方面有重要作用。組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因是一種帶有Kunitz型結構域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，可通過影響細胞外基質的重塑參與組織發(fā)生、傷口愈合、血管生成、腫瘤的侵襲轉移等生理病理過程。TFPI-2作為一種抑癌基因，在非小細胞肺

2、癌、肝細胞癌、前列腺癌等人類多種腫瘤中由于啟動子甲基化而沉默，從而使其抑制細胞生長及促進細胞凋亡的作用喪失。目前有關急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者TFPI-2甲基化的相關研究國內外報道較少，TFPI-2甲基化與AML發(fā)生及發(fā)展的關系尚不明確。本研究檢測AML患者在初診、緩解及復發(fā)/難治階段TFPI-2基因的表達情況，TFPI-2啟動子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)，結合患者臨床特征，以探討TFPI-

3、2基因在AML中的臨床意義。
　　第一部分TFPI-2基因在急性髓系白血病的表達改變
　　目的：檢測TFPI-2基因在AML患者骨髓單個核細胞中的表達水平，以初步了解TFPI-2基因在AML中的作用，探討其與AML發(fā)生、發(fā)展及危險度分層及預后的關系。
　　方法：
　　1.分離33例初治、19例完全緩解、12例復發(fā)/難治AML患者及15例單純缺鐵性貧血患者（對照組）骨髓單個核細胞，采用實時定量PCR檢測TFPI-2

4、mRNA在其中的表達水平，分析TFPI-2表達與AML患者臨床特征的關系。
　　2.將初治AML患者按化療效果分為完全緩解組(CR)和未完全緩解組（包括PR和NR），用Mann-Whitney U檢驗比較兩組間TFPI-2mRNA的表達水平。
　　3.應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理，實時定量資料屬于非正態(tài)計量資料，數(shù)據(jù)用中位數(shù)和范圍表示，多組間TFPI-2mRNA表達水平的比較采用Kruskal-Wallis檢驗

5、，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.AML各組與對照組中TFPI-2mRNA的表達初治組、完全緩解組及復發(fā)/難治組AML患者TFPI-2mRNA表達水平均低于對照組（P均＜0.05）;復發(fā)/難治組TFPI-2mRNA表達水平明顯低于初治組(P=0.006);與完全緩解組相比，初治組TFPI-2mRNA表達水平也顯著降低(P=0.030)。
　　2.TFP

6、I-2的表達水平與臨床療效的關系初治組經(jīng)2個療程化療后，完全緩解組(CR)骨髓單個核細胞TFPI-2mRNA表達量顯著高于未完全緩解組(PR+NR)(P=0.031)。23例獲完全緩解AML患者緩解后骨髓中TFPI-2mRNA中位表達水平顯著高于化療前(P=0.044);10例未獲完全緩解AML患者2個標準化療后骨髓中TFPI-2mRNA中位表達水平與治療前比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.TFPI-2mRNA表達水

7、平與AML病程的關系本研究對4例初治AML患者進行隨訪，其中例1、例2患者化療前TFPI-2水平低表達，化療后患者達CR后TFPI-2水平轉為高表達，并處于持續(xù)CR狀態(tài)。例3患者TFPI-2表達維持在較低水平，最終因治療無效而死亡。例4患者化療后達CR，TFPI-2表達持續(xù)高水平，于治療第5個月TFPI-2mRNA的表達水平明顯降低，該患者于1個月后出現(xiàn)白血病復發(fā)。
　　4.TFPI-2基因mRNA表達水平與AML患者臨床特征間的

8、關系TFPI-2基因的mRNA表達水平與AML患者年齡、性別、初診時白細胞數(shù)、FAB分型及染色體核型均無相關性(P＞0.05)。
　　結論：
　　1.初治組、復發(fā)/難治組及完全緩解組AML患者骨髓單個核細胞中TFPI-2表達水平均低于對照組（P均＜0.05），提示TFPI-2表達水平降低與AML的發(fā)生及預后密切相關。
　　2.AML患者經(jīng)治療后獲完全緩解者，其TFPI-2表達水平較未完全緩解者明顯升高，提示TFPI-2

9、高表達者，完全緩解率高，TFPI-2與AML的治療預后相關;AML患者完全緩解后，其TFPI-2表達水平較治療前明顯升高，進一步說明TFPI-2的表達水平與AML患者的病情進展有關。
　　3.治療前TFPI-2低表達的AML患者經(jīng)化療獲CR后TFPI-2的表達水平可升高;未能獲得CR者，TFPI-2的表達維持在較低水平;獲得CR的AML患者在復發(fā)前，出現(xiàn)TFPI-2表達水平的升高后再次降低，因此，通過檢測AML患者TFPI-2的表

10、達水平，對發(fā)現(xiàn)AML的早期復發(fā)及判斷預后有一定意義。
　　4.TFPI-2基因表達水平與患者年齡、性別、初診時白細胞數(shù)、FAB分型及染色體核型均無顯著相關性。提示TFPI-2的表達可能是一項獨立于這些臨床特征的預后相關因素。
　　第二部分急性白血病TFPI-2基因啟動子甲基化狀態(tài)的檢測及分析
　　目的：檢測AML患者TFPI-2基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)。分析其與TFPI-2表達下調的關系，以進一步探討其與AML發(fā)生

11、、預后的關系。
　　方法：
　　1.分離33例初治、19例完全緩解、12例復發(fā)/難治AML患者（對照組）骨髓單個核細胞，采用甲基化特異性PCR檢測啟動子CpG島甲基化狀態(tài)，15例單純缺鐵性貧血患者作為對照組。
　　2.應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理，計數(shù)資料之間的差異比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.64例AML患者TFPI-2基因啟動

12、子甲基化頻率為64.63％(42/64)，其中初治組、完全緩解組和復發(fā)/難治組患者中TFPI-2基因啟動子甲基化頻率分別為66.67％(22/33)、52.63％(10/19)和83.33％(10/12)，各組間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對照組骨髓單個核細胞中未檢測到TFPI-2基因啟動子的甲基化。
　　2.甲基化AML患者與非甲基化AML患者骨髓單個核細胞中TFPI-2mRNA的相對表達量分別是0.165(0.005-2

13、.099)和0.597(0.011-2.787)，兩組間比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.TFPI-2基因甲基化與AML患者臨床特征間的關系TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)與AML患者年齡、性別、初診時白細胞數(shù)、血紅蛋白、血小板、FAB分型、染色體核型及診斷分期均無相關性(P＞0.05)。
　　結論：
　　1.AML患者TFPI-2基因啟動子甲基化頻率為64.63％(42/64)，且難治組AML患者TFPI-2甲

14、基化頻率明顯高于初治組和完全緩解組，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，對照組骨髓單個核細胞中未檢測到TFPI-2基因啟動子的甲基化。提示TFPI-2基因啟動子的異常甲基化可能與AML的發(fā)病密切相關，其甲基化程度升高和表達降低均預示著預后不良，該指標的監(jiān)測對AML預后判斷及化療方案的選擇有一定意義。
　　2.甲基化陽性患者中TFPI-2基因表達水平明顯低于非甲基化患者(P＜0.05)，提示其啟動子CpG島的異常甲基化可能是導致TFP