奶牛乳腺上皮細(xì)胞高溫應(yīng)答機(jī)制的研究.pdf

1、本研究目的在于揭示奶牛乳腺上皮細(xì)胞高溫應(yīng)答機(jī)制及調(diào)控機(jī)理。實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行溫度梯度處理，確定適宜的高溫處理溫度，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究高溫對(duì)乳腺細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及作用機(jī)理。 1.奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 運(yùn)用差酶消化法和反復(fù)貼壁法建立體外奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，采用透射電鏡、細(xì)胞流式術(shù)、免疫組化、免疫印跡等方法對(duì)乳腺上皮細(xì)胞特性進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用本方法建立的奶牛乳腺細(xì)胞

2、系上皮特性及遺傳特征完備。 2.高溫對(duì)乳腺細(xì)胞生物學(xué)特征的影響 實(shí)驗(yàn)通過臺(tái)盼蘭染色、細(xì)胞流式術(shù)等方法研究高溫對(duì)乳腺細(xì)胞活性、細(xì)胞周期及死亡率的影響。結(jié)果表明：(1)40℃/41℃高溫可使乳腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮、線粒體腫脹、空泡化，形成凋亡小體。(2)40℃/41℃高溫可以抑制乳腺細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞產(chǎn)生G<,2>/M期阻滯，誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞死亡，并隨高溫強(qiáng)度的增加而作用增強(qiáng)。(3)40℃/41℃高溫可以誘導(dǎo)

3、乳腺細(xì)胞產(chǎn)生熱耐受性。 3.線粒體通路在高溫誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞死亡中的作用 通過對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增殖、線粒體及相關(guān)分子的檢測(cè)，研究40℃高溫對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的作用機(jī)制。結(jié)果表明，高溫誘導(dǎo)的細(xì)胞的死亡呈經(jīng)典的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即染色體分布邊緣化、線粒體腫脹，線粒體膜電位差(△Ψm)降低，Bax/Bcl-2升高，Capsase-3活性極顯著增加，DNA發(fā)生損傷。說明高溫可通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。 4.高溫應(yīng)激狀態(tài)下乳腺

4、上皮細(xì)胞HSP72的表達(dá)及JNK激酶在乳腺細(xì)胞高溫死亡中的作用 應(yīng)用RT-PCR、免疫組化、細(xì)胞流式術(shù)、JNK特異性激活劑/抑制劑等方法，研究與細(xì)胞熱耐受性密切相關(guān)的HSP72表達(dá)規(guī)律和JNK激酶在乳腺上皮細(xì)胞高溫應(yīng)答中的作用。結(jié)果表明，(1)40℃高溫誘導(dǎo)了奶牛乳腺細(xì)胞HSP72的表達(dá)，協(xié)助細(xì)胞獲得熱耐受性。(2)JNK激酶參與了40℃高溫誘導(dǎo)的乳腺細(xì)胞死亡調(diào)控，抑制JNK激酶活性可以極顯著地降低細(xì)胞死亡率。 本實(shí)驗(yàn)研