LuxS基因缺失對(duì)變異鏈球菌生物學(xué)性狀、生物被膜結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)是通過采用常規(guī)生化鑒定、革蘭氏染色涂片鑒定和生長(zhǎng)曲線測(cè)定等方法闡述了變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS基因突變株在生物學(xué)性狀方面的異同。此外,建立LuxS基因缺失突變株的生物被膜體外模型,用結(jié)晶紫染色等方法觀察變鏈菌生物被膜結(jié)構(gòu),研究LuxS基因突變對(duì)其形成生物被膜的能力的影響,并借助于掃描電鏡觀察了LuxS基因缺失突變株和標(biāo)準(zhǔn)株所形成的生物被膜,為進(jìn)一步研究LuxS信號(hào)系統(tǒng)對(duì)變鏈菌致齲毒力的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:將變

2、鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS突變株分別在含紅霉素及不含紅霉素的TSA固體培養(yǎng)基中作菌落培養(yǎng),觀察兩種菌落的生長(zhǎng)情況并作常規(guī)生化檢測(cè)、革蘭氏染色涂片以比較兩種菌株的生長(zhǎng)特性。將復(fù)蘇24h的標(biāo)準(zhǔn)株及LuxS突變株于紫外分光光度計(jì)600nm處制備成吸光度A=1.0的菌懸液備用。將上述菌懸液1000倍稀釋接種于BHI液體培養(yǎng)基,置于37℃恒溫?fù)u床中孵育,定時(shí)取樣測(cè)量A值,觀察比較兩者在生長(zhǎng)曲線上的差異。將LuxS基因突變株和標(biāo)準(zhǔn)株接種于BHI液體培養(yǎng)基

3、中,培養(yǎng)48h后,取出相應(yīng)的微孔板,結(jié)晶紫染色生物被膜,觀察細(xì)菌生物被膜的形態(tài)變化。將提前制備好的無菌牙釉質(zhì)磨片置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并依次編號(hào)第1-6孔,每孔放置4片,分別取變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS突變株的A600=1.0的菌懸液向每孔中接種1ml(其中第1、4孔接種菌液為標(biāo)準(zhǔn)株,2、3、5、6四孔接種菌液為L(zhǎng)uxS突變株),均勻滴至牙釉質(zhì)磨片表面,靜置約2min后向每孔中加入5mlTPY液體培養(yǎng)基(其中第1、2、3孔為含2％葡萄糖的T

4、PY溶液,4、5、6孔為含2％蔗糖的TPY溶液),然后取提前制備好的標(biāo)準(zhǔn)株上清液各500μl加入至3、6兩孔。將上述菌液于37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h,于掃描電鏡下觀察在無菌牙釉質(zhì)磨片上形成的生物被膜,并進(jìn)行總體評(píng)價(jià)以對(duì)比兩種菌株的生物被膜的形成能力。
　　 結(jié)果:在含紅霉素的TSA-Eymr固體培養(yǎng)基中,標(biāo)準(zhǔn)株基本不能生長(zhǎng),而突變株的生長(zhǎng)狀況基本正常。在不含紅霉素的TSA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),兩種菌株的菌落形態(tài)沒有明顯差別,鏡下可見

5、標(biāo)準(zhǔn)株菌體呈長(zhǎng)鏈狀排列且相互纏繞,而突變株菌體多呈短鏈狀排列,形成長(zhǎng)鏈的較少。通過對(duì)變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS突變株測(cè)定生長(zhǎng)曲線后發(fā)現(xiàn),兩者在生長(zhǎng)模式上并無明顯差異,只是在進(jìn)入生長(zhǎng)的穩(wěn)定期后,兩者在細(xì)菌飽和度上有一定差異,標(biāo)準(zhǔn)株獲得了較群體感應(yīng)基因Luxs的突變株更多的細(xì)胞生長(zhǎng)。在BHI中標(biāo)準(zhǔn)株和突變株均能夠形成生物被膜,但結(jié)構(gòu)存在差異:標(biāo)準(zhǔn)株形成光滑且均勻分布的生物被膜,突變株的生物被膜形態(tài)粗糙。于掃描電鏡下觀,與生長(zhǎng)在補(bǔ)充了2％葡萄糖的

6、TPY液體培養(yǎng)基中的變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株相比,LuxS基因突變株所形成的生物被膜表現(xiàn)型未見明顯差異。在補(bǔ)充了2％蔗糖的TPY液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),LuxS基因突變株所形成的生物被膜的表現(xiàn)型在形態(tài)學(xué)上與標(biāo)準(zhǔn)株形成的生物被膜有明顯的不同,LuxS基因突變株形成較大的團(tuán)簇狀菌落,生成生物被膜的能力下降。結(jié)構(gòu)相對(duì)粗糙,呈松散的蜂房狀,生物被膜基質(zhì)間有較大的間隙,而標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜呈相對(duì)融合的外觀,分布更加均衡。當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)株上清液來彌補(bǔ)突變株時(shí),形成的聚集物要

7、小的多,此時(shí)形成的生物被膜結(jié)構(gòu)介于標(biāo)準(zhǔn)株和突變株之間。
　　 結(jié)論:本研究通過常規(guī)生化鑒定、革蘭氏染色涂片鑒定和生長(zhǎng)曲線測(cè)定等方法證實(shí)了變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS突變株在生長(zhǎng)特性上有一定的差異性,LuxS基因突變可以抑制變鏈菌的生長(zhǎng),并闡述了兩菌株在生物學(xué)性狀方面的異同。此外,通過建立LuxS基因缺失突變株的生物被膜體外模型,用結(jié)晶紫染色等方法觀察了變鏈菌生物被膜結(jié)構(gòu),證實(shí)了LuXS基因突變對(duì)其形成生物被膜的能力有一定影響,掃描電鏡