凋亡抑制基因BI-1在乳腺癌中的表達(dá)及其抗凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、乳腺癌(breast cancer)是婦女最常見的惡性腫瘤之一.近20年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢,嚴(yán)重危害婦女的身心健康.有關(guān)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的研究目前涉及到很多方面,其中凋亡的調(diào)節(jié)對于細(xì)胞的正常發(fā)育和維持自身的穩(wěn)定具有重要意義,有絲分裂的加劇和凋亡受抑制所導(dǎo)致的細(xì)胞生長失控,往往能引發(fā)惡性腫瘤.Bax inhibitor-1(BI-1)是一個新型的抗凋亡基因,它主要通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑參與對細(xì)胞凋亡的調(diào)控,研究表明,在線粒體途徑中,其

2、凋亡抑制功能與Bc1-2和Bax有關(guān),它能與Bc1-2和Bc1-x1發(fā)生相互作用,而不能與Bax和bad發(fā)生相互作用.當(dāng)BI-1在惡性細(xì)胞中呈過度表達(dá)時(shí),它能夠抑制Bax、依托泊甙、十字孢堿以及生長因子剝奪后所引起的凋亡,但不能抑制fas(CD95)所引起的凋亡.近年來,BI-1在惡性腫瘤形成中的作用逐漸被證實(shí),研究發(fā)現(xiàn)BI-1在前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組質(zhì)中表達(dá)較高. 本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot

3、技術(shù)檢測了42例乳腺癌及配對正常乳腺組質(zhì)中BI-1基因的表達(dá),用免疫組質(zhì)化學(xué)技術(shù)檢測了ER、PR、Bc1-2、Be1-x1及P53蛋白在乳腺癌組質(zhì)中的表達(dá)情況,通過分析BI-1基因在乳腺癌和配對的正常乳腺組質(zhì)中的表達(dá)情況,以探討該基因在乳腺癌發(fā)病中的作用,并通過分析BI-1與ER、PR、Bc1-2、Bc1-x1和P53基因表達(dá)的相關(guān)性,探討其在乳腺癌中的抗凋亡機(jī)制,為判斷乳腺癌的預(yù)后、指導(dǎo)臨床診斷和治療提供依據(jù).實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)對象選擇

4、及標(biāo)本采集采集2005年至2006年在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除標(biāo)本42例乳腺癌及其配對正常乳腺組質(zhì)標(biāo)本,標(biāo)本離體于5min內(nèi)放入液氮及甲醛溶液中保存.并搜集病人的年齡、原發(fā)腫塊大小、組質(zhì)學(xué)類型、組質(zhì)學(xué)分級、臨床分期等方面資料. 2.用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR.方法檢測BI-1 mRNA在42對配對的乳腺癌和乳腺正常組質(zhì)中的表達(dá). 采用Trizol試劑提取各組質(zhì)標(biāo)本和:FCM-7細(xì)胞株的RNA,通過1﹪的瓊脂糖

5、凝膠電泳及RNA的OD值評估RNA含量和純度;使用Promega公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增β-actin基因檢測逆轉(zhuǎn)錄效果;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測BI-1基因在各組質(zhì)中的表達(dá);并用FCM-7細(xì)胞株逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,對檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制. 3.用Western blot方法檢測BI-1蛋白在42對配對的乳腺癌和乳腺正常組質(zhì)中的表達(dá)情況. 提取各組質(zhì)標(biāo)本的胞漿總蛋白,并用Bra

6、dford比色法測定蛋白濃度;抗原修復(fù)后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用半干法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,加抗體檢測PVDF膜上的BI-1和β-actin蛋白;ECL發(fā)光法使各蛋白條帶顯色,并用bandscan 5.0軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值測定. 4.用免疫組化SP法,按照試劑盒說明書分別檢測ER、PR、Bcl-2、Bcl-xl和P53蛋白在乳腺癌中的表達(dá). 5.用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 11.0,分別采用配對資料

7、t檢驗(yàn)、單因素方差分析、Pearson相關(guān)性分析、二元變量等級相關(guān)分析和卡方檢驗(yàn)等方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,按雙側(cè)概率α=0.05的水準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,42例乳腺癌中,33例BI-1的表達(dá)明顯高于其相應(yīng)的配對正常乳腺組質(zhì),其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 2.乳腺癌組質(zhì)中,BI-1基因的表達(dá)與患者的年齡、腫塊大小、組質(zhì)學(xué)分級和臨床分期無顯著相關(guān)

8、性(P>0.05),而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組,其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05). 3.Western blot檢測結(jié)果顯示,BI-1蛋白在乳腺癌和配對的正常乳腺組質(zhì)中均有不同程度的表達(dá). 4.相關(guān)性分析表明,在乳腺癌和配對的正常乳腺組質(zhì)中,BI-1mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果一致. 5.乳腺癌組質(zhì)中,ER、PR.Bcl-2、Bcl-xl和P53蛋白的表達(dá)陽性率分別為59.52﹪、54.76﹪、61.9

9、0﹪、59.52﹪和47.62﹪.相關(guān)性分析表明,BI-1的表達(dá)與ER和PR的表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05),而與Bcl-2、Bcl-xl和:P53的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05). 6.在乳腺癌組質(zhì)中,Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05). 結(jié)論 1.BI-1基因在乳腺癌組質(zhì)中的表達(dá)明顯高于其配對的正常乳腺組質(zhì),提示BI-1基因的過度表達(dá)可能促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生. 2.BI-1基因的促腫

10、瘤作用可能發(fā)生在腫瘤形成的早期階段. 3.BI-1基因與乳腺癌的浸潤行為有關(guān),可能參與了淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移. 4.BI-1蛋白不能和ER、PR.聯(lián)合檢測判斷乳腺癌的預(yù)后. 5.在線粒體途徑中,Bcl-2和Bcl-xl均參與了BI-1的抗凋亡過程,選擇性阻斷BI-1、Bcl-2和Bcl-xl的作用,可能成為乳腺癌基因治療的一個新靶點(diǎn). 6.在乳腺癌的發(fā)病中,BI-1和P53在基因表達(dá)的水平上可能發(fā)生某種關(guān)聯(lián)性作用