大豆蚜氣味結合蛋白的結合特性及組織定位.pdf

1、昆蟲能夠借助靈敏的嗅覺有效識別環(huán)境中的各類化學信息物質，產生相應的生理與行為反直,從而準確獲悉食物和配偶的方位并躲避捕食者的傷害，因此嗅覺感知系統(tǒng)對于昆蟲生存、繁衍等一系列生命活動至關重要。將昆蟲嗅覺與防治相結合，已經成為害蟲綜合治理的一個重要手段，并將在未來有害生物的綠色防控中發(fā)揮越來越重要的作用。氣味結合蛋白（Odorant binding proteins, OBPs）是昆蟲嗅覺感知過程中最先發(fā)揮功能的一類蛋白。大豆蚜Soybea

2、n aphid(Aphis glycines Matsumura)是大豆生產中的重要害蟲，主要依靠化學防治，但由于近年來大豆蚜的抗藥性不斷增強，為減少環(huán)境污染及對農作物無公害防治要求，迫切需要尋求新的大豆蚜綠色防治技術。
　　依據已登錄GenBank的豌豆蚜Acyrthosiphon pisum已知基因序列對大豆蚜氣味結合蛋白基因序列進行同源克隆。以大豆蚜總cDNA為底物，利用RT-PCR及RACE技術，成功克隆獲得10種大豆蚜氣

3、味結合蛋白基因（統(tǒng)稱AglyOBPs）即:AglyOBP2，KF923843;AglyOBP3，KF923844; AglyOBP4,KF923845;AglyOBP5,KF923846; AglyOBP6,KF923847; AglyOBP7,KF923848; AglyOBP8, KF923849; AglyOBP9,KF923850; AglyOBP10,KF923851和AglyOBP11，KF923852的完整編碼序列，并登錄

4、GenBank。通過對其氨基酸序列進行分析，發(fā)現各基因均含有氣味結合蛋白家族保守結構域，并分屬于3個不同的氣味結合蛋白家族(Plus-C OBPs、典型OBPs和Minus-C OBPs)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，大豆蚜各AglyOBPs基因分別與棉蚜和豌豆蚜的直系同源基因有比較一致的進化趨勢，為本研究得到AglyOBPs基因確切的家族歸屬提供直接的證據支持，暗示AglyOBPs與寄主生境的選擇壓力存在某種特殊聯系。
　　對其中6種

5、大豆蚜氣味結合蛋白基因構建了重組表達質粒，在大腸桿菌Transetta(DE3)中進行誘導表達，以獲得含有6×His標簽的重組融合蛋白。借助金屬鎳離子Ni2+親和層析技術，成功純化6種AglyOBPs融合蛋白，Western blotting印跡分析結果表明AglyOBPs融合蛋白得到完整表達。經重組牛腸激酶(rEK)切除6×His標簽肽，獲得接近天然狀態(tài)的氣味結合蛋白。以1-NPN為探針，利用熒光競爭結合實驗研究AglyOBPs與寄主

6、大豆揮發(fā)物組份和告警信息素（反-β-法呢烯）的結合特性。結果證實AglyOBP2、AglyOBP3、AglyOBP4、AglyOBP7、AglyOBP8和AglyOBP9對C6～C8的小分子氣味物質有廣譜的結合特性，但結合能力存在一定的差別。其中，AglyOBP2對東農46大豆揮發(fā)物組份的結合能力最強，對小分子醇、醛和酯類氣味分子都表現出較高的親和活性，對2-甲基-4-戊烯醛、順-3-己烯醇、順-2-己烯醇和反-2-己烯醇等綠葉氣體也都

7、能很好的結合，表明AglyOBP2在識別寄主揮發(fā)物的過程中可能發(fā)揮重要作用。同時，研究發(fā)現AglyOBP7能特異性的結合反-β-法呢烯氣味(Ki為1.6μM)，表明AglyOBP7很可能是識別大豆蚜告警信息素的重要功能蛋白。
　　利用實時熒光定量PCR技術（Real-time Fluorescent Quantitative PCR, RT-qPCR）對6種AglyOBPs基因(AglyOBP2、AglyOBP3、AglyOBP4

8、、AglyOBP7、AglyOBP8和AglyOBP9）在大豆蚜不同發(fā)育期的表達情況及在有翅成蚜各組織中的表達定位進行分析。結果表明，6種AglyOBPs在大豆蚜各生長發(fā)育階段均有表達，并且均在4齡期若蚜有一個表達高峰，成蚜期又下降恢復到之前的水平，這種現象暗示了6種AglyOBPs基因在大豆蚜從若蚜進入成蚜這個階段可能發(fā)揮了特定的作用。除AglyOBP7在有翅成蚜和無翅成蚜發(fā)育階段的表達量相當外，其余5種AglyOBPs在有翅成蚜中的

9、表達量均高于無翅成蚜，這種表達差異反映出這6種AglyOBPs在大豆蚜有翅成蚜搜尋寄主過程中發(fā)揮重要作用。6種AglyOBPs在大豆蚜觸角組織中均有表達，但表達量顯著不同。AglyOBP2、AglyOBP7和AglyOBP9在觸角組織的表達量顯著高于其它組織，推測這3種氣味結合蛋白參與大豆蚜觸角的嗅覺識別過程。AglyOBP3、AglyOBP4和AglyOBP8均在觸角以外的組織（頭、足和翅）中超量表達，推測這些組織表面可能存在嗅覺感器