可溶性PD-1和PD-L1分子對(duì)PD-1-PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用及其生物學(xué)意義.pdf

1、協(xié)同刺激信號(hào)在T細(xì)胞參與免疫應(yīng)答的起始、效應(yīng)和終止等不同階段都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用且需要達(dá)到相對(duì)平衡。PD-1/PD-L途徑介導(dǎo)的負(fù)性信號(hào)能有效抑制T、B細(xì)胞功能，在機(jī)體免疫應(yīng)答后期的負(fù)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，并在腫瘤免疫、自身免疫、移植免疫和慢性病毒感染等疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物學(xué)意義。
　　 PD-1(CD279)為負(fù)性協(xié)同刺激分子受體，其最顯著的特征是胞漿區(qū)含有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和一個(gè)免疫受

2、體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)。PD-1主要在活化的T、B和NK等細(xì)胞上呈誘導(dǎo)性表達(dá)，PD-1有PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)兩個(gè)配體。PD-L1和PD-L2同屬B7超家族，在蛋白結(jié)構(gòu)上均包含有IgV樣區(qū)、IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)和一個(gè)短而保守的胞漿區(qū)。PD-L1廣泛組成性表達(dá)于多種實(shí)質(zhì)器官組織、免疫細(xì)胞以及多種類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞上，而PD-L2僅表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞和個(gè)別

3、腫瘤細(xì)胞株。研究表明，PD-1隨T細(xì)胞活化程度逐步上調(diào)表達(dá)，PD-1/PD-L相互作用后觸發(fā)ITSM基序募集信號(hào)分子SHP-2，引發(fā)抑制信號(hào)的產(chǎn)生，致使效應(yīng)性T細(xì)胞失能并及時(shí)進(jìn)入凋亡。因此，PD-1/PD-L途徑對(duì)T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中恰當(dāng)而有效的調(diào)節(jié)具有重要的生物學(xué)意義，通過(guò)研究PD-1/PD-L與多種臨床疾病的相關(guān)性，闡明其作用機(jī)理，有望為這些疾病的免疫治療提供新策略。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，多種協(xié)同刺激分子能分別以細(xì)胞膜型和可溶

4、性兩種形式存在，包括CD28、CTLA-4、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3和B7-H4等。可溶性分子可以通過(guò)蛋白水解酶裂解細(xì)胞上的膜型分子而形成，也可由專(zhuān)一的mRNA直接編碼產(chǎn)生。有些可溶性分子具有臨床診斷價(jià)值。
　　 本研究旨在構(gòu)建基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/PD-1和L929/PD-L1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研制鼠抗人PD-1和PD-L1單克隆抗體，并對(duì)單抗的生物學(xué)特性進(jìn)行研究；分別建立特異性檢測(cè)人sPD-1和sPD-L1的

5、ELISA方法，并對(duì)ELISA檢測(cè)體系的穩(wěn)定性和精確性等進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)；利用sPD-I的ELISA方法對(duì)健康人和自身免疫病患者外周血中的sPD-1表達(dá)水平及特性進(jìn)行分析，同時(shí)，對(duì)sPD-1的產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行研究，探討該可溶性因子對(duì)PD-1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用及其在自身免疫病中的生物學(xué)意義；應(yīng)用建立的ELISA分析sPD-LI在人外周血和多種體外培養(yǎng)細(xì)胞上清中的表達(dá)特性，研究功能性sPD-L1的產(chǎn)生機(jī)制及其對(duì)T細(xì)胞的協(xié)同刺激效應(yīng)，分析肺

6、癌患者外周sPD-L1的表達(dá)及其與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的相關(guān)性。這些研究結(jié)果為闡明sPD-1和sPD-L1對(duì)PD-1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用及其生物學(xué)意義提供了新的線索。
　　 一、鼠抗人PD-1和PD-L1單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性的研究
　　 [目的]研制特異性鼠抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體，為研究人PD-1/PD-L1分子在免疫細(xì)胞上的表達(dá)特性和探討該抑制途徑對(duì)人免疫細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)提供必要的物質(zhì)材料。

7、>　　 [方法]以穩(wěn)定高表達(dá)人PD-1、PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/PD-1、和L929/PD-L1為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并以基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞和融合蛋白通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，將鑒定后符合要求的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行反復(fù)篩選和多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得多株分泌特異性鼠抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；采用Ig亞型快速定性試紙法、單抗/單抗或

8、單抗/蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)、Westernblot和ELISA等試驗(yàn)，對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；用間接免疫熒光法分析PD-1、PD-L1在不同類(lèi)型細(xì)胞表面的表達(dá)特性；應(yīng)用獲得的單抗對(duì)人T、DCs等細(xì)胞進(jìn)行體外生物學(xué)功能的研究。
　　 [結(jié)論]成功菝得多株新的鼠抗人PD-1、PD-L1單克隆抗體，識(shí)別不同抗原表位的單抗為進(jìn)一步應(yīng)用于研制ELISA試劑盒，從而用于測(cè)定可溶性蛋白因子奠定了良好基礎(chǔ)。上述單抗的研制也為揭示

9、膜型PD-1和PD-L1的表達(dá)特性，探討PD-1/PD-L1抑制途徑對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其生物學(xué)意義提供了必要的物質(zhì)材料。
　　 二、特異性檢測(cè)人可溶性PD-1、PD-L1蛋白ELISA試劑盒的研制
　　 [目的]研制特異性高靈敏度檢測(cè)人sPD-1和sPD-L1的ELISA試劑盒，為定量分析不同來(lái)源的臨床標(biāo)本和研究這兩種可溶性因子的功能提供有效的檢測(cè)手段。
　　 [方法]利用anti-PD-1mAb(489)作

10、包被抗體在碳酸鹽緩沖液中預(yù)包被ELISA板，biotin-anti-PD-1mAb(9H1)作為檢測(cè)抗體識(shí)別與489相結(jié)合的抗原，再與Streptavidin-HRP反應(yīng)，最后用TMB底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，建立雙抗體夾心sPD-1酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒。利用相同批次多組檢測(cè)孔進(jìn)行精確性分析，利用相同批次ELISA板在不同測(cè)定時(shí)間點(diǎn)的準(zhǔn)確性進(jìn)行試劑盒穩(wěn)定性分析。同樣的方案，用anti-PD-L1mAb(2Hll)作為包被抗體和biotin-anti-

11、PD-L1mAb(10D7)作為檢測(cè)抗體建立特異性檢測(cè)人sPD-L1的ELISA體系。
　　 [結(jié)論]特異性高靈敏度檢測(cè)人sPD-1和sPD-L1ELISA試劑盒的建立為定量分析PD-1/PD-L1抑制途徑中可溶性蛋白因子提供了有效的檢測(cè)手段。
　　 三、sPD-1表達(dá)的特性及其對(duì)PD-1/PD-L1途徑的阻斷作用和在自身免疫病理中的意義
　　 [目的]揭示健康人外周血中sPD-1表達(dá)的特性，闡明機(jī)體中sPD-1

12、的產(chǎn)生機(jī)制，探討sPD-1在自身免疫病患者外周異常表達(dá)的意義及其對(duì)PD-1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用。
　　 [方法]利用自主研制的sPD-1ELISA試劑盒檢測(cè)分析不同年齡段健康人外周血中sPD-1的表達(dá)求平；流式細(xì)胞術(shù)和ELISA分析人T細(xì)胞在體外刺激活化過(guò)程中膜型和可溶性PD-1的表達(dá)特性；通過(guò)RT-PCR和TP-PCR法克隆人全長(zhǎng)PD-1(flPD-1)、缺失外顯子3的PD-1(PD-1Aex3)和PD-1胞外段(sPD

13、-1)基因，構(gòu)建plRES2-EGFP/flPD-1、plRES2-EGFP/PD-1Aex3和plRES2-EGFP/sPD-l重組真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)收集基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)分析細(xì)胞膜上PD-1的表達(dá)，用Westernblot和sPD-1ELISA方法對(duì)各轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中sPD-1進(jìn)行定性和定量分析；合成PD-1蛋白胞內(nèi)段特定的抗原肽，免疫新西蘭兔制備兔抗人PD-1胞內(nèi)段多抗；免疫

14、沉淀技術(shù)收集人血清中的sPD-1并進(jìn)行Westernblot，應(yīng)用兔抗人PD-1胞內(nèi)段多抗與sPD-1蛋白雜交顯色，進(jìn)而鑒定sPD-1蛋白特性；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析sPD-1蛋白與PD-L1、PD-L2的結(jié)合能力；利用sPD-1ELISA和Westernblot方法對(duì)自身免疫病患者（Graves’、RA和HSP）外周血中該因子進(jìn)行定量和定性分析。
　　 [結(jié)論]功能性sPD-1存在并高表達(dá)于自身免疫病患者外周為進(jìn)一步闡明sPD-

15、1對(duì)PD-1/PD-L1抑制信號(hào)的阻斷作用開(kāi)拓了新的途徑，為探討該可溶性因子在生理和自身免疫病理?xiàng)l件下的生物學(xué)意義奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 四、sPD-L1表達(dá)的特性及其對(duì)PD-1/PD-L1途徑促進(jìn)作用和在腫瘤免疫逃逸中的意義
　　 [目的]應(yīng)用sPD-L1ELISA揭示健康人外周血和多種體外培養(yǎng)細(xì)胞上清中sPD-L1表達(dá)的水平和特性，闡明sPD-L1的產(chǎn)生機(jī)制，探討sPD-L1在腫瘤患者外周異常表達(dá)的意義及其對(duì)PD-

16、1/PD-L1途徑的調(diào)節(jié)作用。
　　 [方法]利用自主研制的sPD-L1ELISA試劑盒檢測(cè)分析健康人外周血中sPD-L1的表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)和ELISA分析人Mo-DCs在體外誘導(dǎo)分化成熟過(guò)程中膜型PD-L1(mPD-L1)和可溶性PD-L1(sPD-L1)的表達(dá)特性；ELISA法檢測(cè)分析多種mPD-L1+和mPD-LI-細(xì)胞株產(chǎn)生sPD-L1的水平；應(yīng)用免疫沉淀和Westernblot技術(shù)鑒定sPD-L1蛋白的分子量；在高

17、表達(dá)sPD-L1的L929/PD-L1和Mo-DCs細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入金屬蛋白酶抑制劑(MMPI)，于不同時(shí)間分析sPD-L1的表達(dá)量；通過(guò)與PD-1Ig融合蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析sPD-L1的生物學(xué)活性；應(yīng)用CCK-8摻入法體外研究sPD-L1對(duì)T細(xì)胞增殖和活化的抑制作用；利用sPD-L1ELISA分析該因子在肺癌患者外周血中的表達(dá)水平，將獲得的結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件與各項(xiàng)臨床指標(biāo)作相關(guān)性分析。
　　 [結(jié)論]人外周血中存在的功能性sPD