Real-time PCR檢測(cè)感染宿主血清日本血吸蟲DNA水平動(dòng)態(tài)變化及其在血吸蟲病診斷和療效考核中的意義.pdf

1、第一部分日本血吸蟲Taqman real-time qPCR法的建立
　　目的：建立一種靈敏、高效的日本血吸蟲Taqman real-time PCR定量檢測(cè)法，并評(píng)價(jià)其特異性與敏感性。
　　方法：以日本血吸蟲高度重復(fù)基因SjR2為靶序列設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，收集日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲以及肺吸蟲成蟲，并抽提不同成蟲模板，將普通PCR擴(kuò)增的日本血吸蟲SjR2產(chǎn)物純化克隆，用real-time PCR法進(jìn)行

2、擴(kuò)增。
　　結(jié)果：曼氏血吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲、肺吸蟲成蟲模板擴(kuò)增曲線均在閾值水平以下，只有日本血吸蟲擴(kuò)增曲線在閾值線以上，并呈指數(shù)狀分布。將以上各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，只有日本血吸蟲泳道出現(xiàn)77bp特異性目的條帶；將日本血吸蟲SjR2基因重組質(zhì)粒連續(xù)10倍稀釋11個(gè)梯度，可檢測(cè)到質(zhì)粒最小濃度為4.47×10copies/μl，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-3.0987x+49.158，相關(guān)系數(shù)為0.9965。
　　結(jié)

3、論：Taqman real-time PCR檢測(cè)法敏感度高、特異性強(qiáng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分 Real-time PCR法對(duì)日本血吸蟲感染家兔血清DNA的定量檢測(cè)及感染度的評(píng)價(jià)
　　目的：評(píng)價(jià)real-time qPCR法應(yīng)用于日本血吸蟲感染宿主血清DNA的早期診斷價(jià)值，并探索宿主血清DNA動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及感染宿主血清DNA水平與感染度的相關(guān)性。
　　方法：雙性感染家兔模型的建立：分別感染30、50、100、

4、200和500條日本血吸蟲雙性尾蚴；單性感染家兔模型的建立：感染日本血吸蟲單性尾蚴200條。收集每只家兔感染后3d~7w外周血清，通過real-time PCR法檢測(cè)。
　　結(jié)果：real-time PCR法從感染后3d的血清模板中即可擴(kuò)增到陽(yáng)性產(chǎn)物，其早期檢測(cè)閾值為54.36個(gè)拷貝數(shù)；在日本血吸蟲雙性尾蚴感染的模型中，宿主血清DNA濃度呈上升趨勢(shì)，且感染5w以后血清DNA濃度明顯升高，特別是感染家兔血清DNA水平與感染度呈顯著正

5、相關(guān)，可用于感染度的評(píng)價(jià)。
　　結(jié)論：real-time PCR法敏感性高、特異性好，除具有診斷價(jià)值外還可以根據(jù)檢測(cè)的閾值，評(píng)價(jià)宿主感染度，為進(jìn)一步應(yīng)用于日本血吸蟲病的診斷及療效考核提供了新的檢測(cè)方法。
　　第三部分 Real-time PCR法對(duì)日本血吸蟲感染家兔血清DNA檢測(cè)用于短期療效考核的評(píng)價(jià)
　　目的：探索單、雙性感染宿主經(jīng)吡喹酮治療后宿主血清DNA的動(dòng)態(tài)變化評(píng)價(jià)real-time qPCR法應(yīng)用于日本血吸蟲

6、病的短期（6個(gè)月內(nèi)）療效考核價(jià)值。
　　方法：建立分別感染200條雙性尾蚴和200條單性尾蚴的家兔模型，感染后7w、8w先后2次各按150 mg／kg體重的劑量給予每只兔子吡喹酮?dú)⑾x治療(頓服)。收集治療后1d~1w(每天)、2w~23w(每周)外周血清，以real-time PCR法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：在雙性感染200條尾蚴的家兔模型中，real-time PCR法從治療后1d~1w及2w~17w的家兔血清中均能檢測(cè)到日

7、本血吸蟲特異性目的基因，轉(zhuǎn)陰閾值為49.29拷貝，治療后一周內(nèi)宿主血清DNA濃度每日檢測(cè)結(jié)果呈逐步上升趨勢(shì)，治療一周以后血清DNA濃度逐漸下降；在感染200條單性尾蚴的家兔模型中，治療后一周內(nèi)宿主血清DNA濃度同樣呈逐步上升趨勢(shì)，隨后DNA濃度逐漸下降，并在治療后第5w血清DNA的檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，其轉(zhuǎn)陰閾值為1784.25拷貝，與雙性感染組治療后第9w檢測(cè)的血清DNA濃度(1846.24拷貝)相當(dāng)。
　　結(jié)論：對(duì)比單、雙性感染組

8、治療后血清DNA定量檢測(cè)結(jié)果顯示，雙性感染的家兔血清DNA在治療后第9w時(shí)的濃度為1846.24拷貝，與同步單性感染組血清DNA第5w轉(zhuǎn)陰時(shí)的閾值（1784.25拷貝）相當(dāng)。提示此時(shí)雙性感染宿主血清蟲體DNA已轉(zhuǎn)陰，此時(shí)間節(jié)點(diǎn)可作為療效考核時(shí)間，而無需等到血清DNA完全轉(zhuǎn)陰。研究結(jié)果表明，real-time PCR法對(duì)日本血吸蟲感染宿主血清蟲體DNA的定量檢測(cè)應(yīng)用于療效考核，可縮短療效考核的時(shí)間節(jié)點(diǎn)更適宜于血吸蟲病流行區(qū)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

9、>　　第四部分 Real-time PCR法對(duì)血清DNA定量檢測(cè)用于日本血吸蟲病人的診斷及感染度的評(píng)價(jià)
　　目的：評(píng)價(jià)real-time PCR法對(duì)日本血吸蟲病病人血清DNA的檢測(cè)效果，并探索病人血清DNA濃度與其感染度（EPG）的相關(guān)性，以證明其潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：收集41例經(jīng)糞檢法、ELISA和IHA血清學(xué)檢測(cè)均呈陽(yáng)性的日本血吸蟲病慢性期病人血清及30例糞檢法、ELISA和IHA檢測(cè)均為陰性的健康人血清，用r

10、eal-time PCR法進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：41例病人血清中有39例檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為95.1%，30例正常人血清DNA檢測(cè)結(jié)果均為陰性，無假陽(yáng)性；日本血吸蟲病病人血清DNA水平與EPG在總體上呈正相關(guān)性。
　　結(jié)論：real-time PCR定量檢測(cè)法靈敏度高、特異性好，不僅可用于血吸蟲感染宿主的診斷還可根據(jù)血清DNA檢測(cè)閾值評(píng)價(jià)患者感染度，特別是可根據(jù)不同感染度患者經(jīng)吡喹酮治療后血清蟲體DNA轉(zhuǎn)陰閾值作為評(píng)價(jià)療