腸出血性大腸桿菌（EHEC）O157：H7 EspA B細(xì)胞表位的鑒定及免疫學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)O157:H7(本文簡稱O157)是一種重要的人畜共患傳染病病原菌。自1982年被確認(rèn)為致病菌以來的20多年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHECO157:H7感染可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagiccolitis，HC)，還可在5～10％的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolyticuremicsyndrome，

2、HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險(xiǎn)性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。 EHEC與宿主腸道粘膜上皮細(xì)胞的粘附是疾病發(fā)展的第一步。介導(dǎo)O157細(xì)菌粘附定植的主要結(jié)構(gòu)單元是III型分泌系統(tǒng)(type-IIIsecretionsystem,TTS

3、S)。EspA(Esp為E.colisecretedprotein縮寫)是一個(gè)中空的三維立體管道結(jié)構(gòu)，是組成腸出血性大腸桿菌O157:H7III型分泌系統(tǒng)的重要成分。跨膜蛋白Tir以及其他III型分泌系統(tǒng)都是通過此通道進(jìn)入宿主的[3]。EspA基因全長579bp，表達(dá)的蛋白分子量約為25kDa，EspA在O157表面表達(dá)，并以多聚體形式存在，具有很強(qiáng)的免疫原性[3]，在O157致病過程中發(fā)揮重要作用。 本研究擬通過制備抗。Esp

4、A的單克隆抗體，并以該單抗作為研究工具鑒定EspAB細(xì)胞表位及其免疫學(xué)性質(zhì)，為研究EspA的生物學(xué)功能及其在粘附定植中作用提供依據(jù)，并以之來闡明O157：：H7的致病機(jī)理，尋找預(yù)防、控制和治療O157:H7感染的手段。 方法 1.抗EspA單克隆抗體制備和純化 應(yīng)用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備抗EspA的單克隆抗體，用飽和硫酸銨(saturatedammoniumsulfate，SAS)沉淀法和HiTraprProtein

5、A柱純化單抗。 2.單抗生物學(xué)活性鑒定 以非競爭ELISA法測定單抗的親和常數(shù)；以結(jié)合相加實(shí)驗(yàn)對單抗識別的表位進(jìn)行初步鑒定；以Westernblot鑒定單抗與重組蛋白結(jié)合的特異性；以間接免疫熒光檢測單抗與O157Sakai菌EspA蛋白結(jié)合的特性。 3.EspA表位的初步預(yù)測 通過生物信息學(xué)對EspA蛋白的親水性、抗原性和表面可及性等進(jìn)行分析并結(jié)合EspA蛋白功能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，選擇性的將EspA蛋白分成6

6、段：E1，E2，E3，E4，E5和E6。 4.EspA表位的構(gòu)建表達(dá) 采用PCR方法從EHECO157:H7Sakai基因組中擴(kuò)增E1，E2，E3，E4，E5和.E6目的基因片段，分別構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-28a和pET-22b中，通過酶切鑒定及送檢測序陽性重組子。將陽性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Tris-TricinePAGE電泳確定目的蛋白表達(dá)。 5.EspAB細(xì)胞表位的篩選

7、 以Westernblot鑒定方法將單抗與EspA的6個(gè)片段分別反應(yīng)，初步確定針對EspA的表位區(qū)域，將這個(gè)區(qū)域采用步移合成法合成7條多肽，通過Dotblot和ELISA雙重鑒定，精確定位單克隆抗體所針對的B細(xì)胞抗原表位。 6.表位的免疫學(xué)性質(zhì)鑒定 將EspAB細(xì)胞表位與載體蛋白BSA應(yīng)用戊二醛偶聯(lián)，將偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，同時(shí)做單一表位組和BSA對照組。分別于0、14、28，31天免疫接種，劑量約為100μg

8、/只/次。末次免疫4天后，ELISA檢測血清效價(jià)，測定抗體水平。并通過免疫印跡及免疫熒光方法檢測抗血清能否識別重組及天然EspA，以此評價(jià)由表位制備的抗血清的免疫功能。 7.FAS實(shí)驗(yàn)評價(jià)單抗及表位多抗的生物學(xué)功能 通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)分別檢測單抗及表位多抗阻斷宿主細(xì)胞激動蛋白聚集的能力，并將兩者作比較。 結(jié)果： 1.通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)制備得到3株抗EspA單克隆抗體，并用HiTraprProteinA柱對

9、單克隆抗體進(jìn)行純化，純度達(dá)90％以上 2.通過免疫印跡、ELISA、免疫熒光、結(jié)合相加等實(shí)驗(yàn)對抗體的特異性、親和力、與天然蛋白的免疫反應(yīng)性、識別抗原表位等都得到了證實(shí)。 3.采用生物信息學(xué)和表位作圖相結(jié)合的方法應(yīng)用制備的單抗鑒定EspA抗原B細(xì)胞表位。PCR方法從O157基因組中分別擴(kuò)增出E1(198bp)、E2(240bp)、E3(306bp)、E4(375bp)、E5(345bp)和E6(270bp)片段的堿基序列，

10、并分別成功構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a和pET22b上，分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Tris-TricinePAGE證實(shí)目的蛋白的表達(dá)，并經(jīng)免疫印跡證實(shí)，抗EspA單克隆抗體1H10能夠與E2(40～120aa)、E3(90～192aa)、E4(67～192aa)、E5(77～192aa)和E6(100～192aa)目的蛋白發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)；單克隆抗體2A3與目的蛋白E4(67～192aa)和E5(77～192aa)發(fā)生特異反應(yīng)；單克隆

11、抗體3E5與目的蛋白E2(40～120aa)發(fā)生特異反應(yīng)。初步證實(shí)單克隆抗體1H10所識別的抗原表位位于EspA蛋白N端第100～120位氨基酸內(nèi)，而2A3、3E5所識別的抗原表位疑為構(gòu)象型表位。 4.采用步移合成表位多肽方法，分別合成E67～90aa，E70～95aa，E75～100aa，E80～105aa，E85～110aa，E90～115aa和E100～120aa7條多肽。通過ELISA和Dotblot方法證實(shí)，單克隆抗體

12、1H10所對應(yīng)的B細(xì)胞抗原表位為：EspA蛋白N端第100～120位氨基酸，2A3、3E5不與任何一段多肽結(jié)合，確定兩者均識別構(gòu)象型表位。 5.合成的表位多肽E100～120能夠競爭抑制單克隆抗體1H10與EspA的抗原抗體反應(yīng)，且抑制效應(yīng)具有劑量依賴性，當(dāng)EspA蛋白濃度為2μg/ml、單克隆抗體濃度為12μg/ml、表位多肽E100～120濃度分別為0.02、0.04、0.2、1、2μg/ml時(shí)，根據(jù)OD值的變化情況，按公式

13、計(jì)算抑制率，抑制率分別為7％、27％、58％、84％和96％。 6.應(yīng)用戊二醛將表位多肽E100～120與載體蛋白BSA進(jìn)行偶聯(lián)，制備偶聯(lián)物，并將其免疫BALB/c小鼠，產(chǎn)生的抗血清其效價(jià)高達(dá)1:25600，并且表位與載體蛋白偶聯(lián)物免疫后的抗血清能夠與天然O157菌株的EspA發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)E100～120具有免疫原性，可以作為O157疫苗的候選抗原成分。 7.通過FAS實(shí)驗(yàn)對EspA生物功能進(jìn)行了初

14、步研究，表明多肽抗血清和單克隆抗體均能夠阻斷肌動蛋白的聚集，也就更進(jìn)一步證明EspA在A/E損傷的產(chǎn)生中起到非常重要的作用。 結(jié)論： 1.采用雜交瘤技術(shù)制備得到了3株抗EspA單克隆抗體，并對3株單抗的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。 2.以單抗1H10篩選到一個(gè)：EspA的優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位，位于EspA第100-120個(gè)氨基酸，該表位表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。 3.單抗2A3、3E5可能分別針對兩個(gè)不同