黃原膠注射液的研制及其對實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎療效和作用機(jī)制的研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以關(guān)節(jié)軟骨的破壞和骨質(zhì)增生為特點(diǎn)的最常見的慢性骨關(guān)節(jié)病，是導(dǎo)致老年人關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙的主要原因之一。OA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為是由多因素參與的復(fù)雜病變過程，與年齡、創(chuàng)傷、炎癥、職業(yè)、肥胖、代謝和遺傳等有關(guān)。OA的治療方法主要包括手術(shù)、藥物和輔助治療3種。其中，藥物治療是早中期OA的首選方法。多年基礎(chǔ)和臨床研究證明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射玻璃酸鈉(sodiumhyaluronate，SH)對O

2、A的療效顯著。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射SH可起到潤滑和緩沖作用，減少關(guān)節(jié)組織間摩擦，而且SH還可以減輕和緩解疼痛。但SH不穩(wěn)定，易被體內(nèi)酶和自由基降解，作用時間較短，反復(fù)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射還可能造成關(guān)節(jié)感染。因此尋找黏彈性高、穩(wěn)定性更好的藥物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療OA具有重要意義。黃原膠(xanthangum，XG)是一種經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)的微生物胞外雜多糖，相對分子質(zhì)量(relativemolecularmass，Mr)為2×106～2×107。由于XG與SH都屬

3、于多糖類藥物，性質(zhì)相近，黏彈性高，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射XG也可起到潤滑和緩沖作用。而且XG不易被體內(nèi)酶和自由基降解，穩(wěn)定性更好，在關(guān)節(jié)腔的存留時間更長，可減少注射次數(shù)，避免關(guān)節(jié)感染。因此XG有可能成為治療OA新藥。本課題確定了XG工業(yè)化發(fā)酵工藝和注射用XG原料藥制備工藝，生產(chǎn)出高M(jìn)r、高質(zhì)量的注射用XG原料藥;確定了XG注射液配方，制備了高質(zhì)量的XG注射液;通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評價了XG注射液的安全性;制備了體內(nèi)和體外OA模型，考察了XG注射液對

4、實(shí)驗(yàn)性O(shè)A的療效和作用機(jī)制。
　　 1.注射用黃原膠原料藥的制備工藝及質(zhì)量控制
　　 目的:確定XG工業(yè)化發(fā)酵工藝和注射用XG原料藥制備工藝，建立注射用XG原料藥質(zhì)量控制方法。方法:以發(fā)酵液黏度及產(chǎn)膠量為考察指標(biāo)，在10L發(fā)酵罐中對碳源濃度和接種量進(jìn)行優(yōu)化，確定最終發(fā)酵工藝條件，并進(jìn)行50L規(guī)模的中試放大以及10t規(guī)模的工業(yè)化試產(chǎn)。先確定注射用XG原料藥制備的主要步驟，然后通過正交試驗(yàn)考察影響每個步驟純化效果的關(guān)鍵因素，

5、確定最佳制備工藝。參考國內(nèi)外已有的藥用輔料級XG質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及與XG性質(zhì)、用途相似的注射用SH原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定注射用XG原料藥質(zhì)量檢查項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)草案。結(jié)果:優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及工業(yè)化發(fā)酵工藝條件為:淀粉5％，硫酸銨0.1％，豆餅粉0.3％，檸檬酸0.1％，硫酸鎂0.01％，碳酸鈣0.02％，接種量5％，溫度28.5℃，pH7.0。注射用XG原料藥制備的主要步驟為:XG粗品制備，粗品溶解，硅藻土吸附，除菌過濾，酶解，活性炭吸附，除碳過濾，

6、微孔濾膜精濾，醇沉，干燥得精制品。主要的質(zhì)量檢查項(xiàng)目為:性狀、鑒別、檢查(溶液的澄清度與顏色、酸堿度、黏度、丙酮酸、吸光度、Mr與Mr分布、蛋白質(zhì)含量、氮含量、異丙醇?xì)埩袅?、干燥失重、灰分、重金屬、砷鹽、鉛含量、細(xì)菌內(nèi)毒素和微生物限度)和含量測定。質(zhì)量檢查結(jié)果表明，注射用XG原料藥各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到或優(yōu)于已有的XG質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及與XG性質(zhì)、用途相似的注射用SH原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到注射用原料藥要求。結(jié)論:確定了XG工業(yè)化發(fā)酵工藝，在放大試產(chǎn)過程

7、中XG的產(chǎn)量及質(zhì)量穩(wěn)定。確定了注射用XG原料藥制備工藝，制備了符合注射用要求的高質(zhì)量、低蛋白質(zhì)含量的XG原料藥。確定了注射用XG原料藥質(zhì)量檢查項(xiàng)目及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2.黃原膠注射液的制備工藝及質(zhì)量控制
　　 目的:確定XG注射液配方及制備工藝，建立XG注射液質(zhì)量控制方法。方法:通過配方篩選確定XG注射液的配方及配制工藝。通過熱穩(wěn)定性考察，確定XG注射液的滅菌方法。采用間羥基聯(lián)苯比色法測定XG注射液的含量，并對該方法進(jìn)

8、行方法學(xué)驗(yàn)證。參考與XG性質(zhì)、用途相似的SH注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確定質(zhì)量檢查項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:XG注射液的配方成分為:1％黃原膠、0.5％氯化鈉、0.44％磷酸二氫鈉和0.7％磷酸氫二鈉。XG注射液的滅菌方法為:121℃滅菌15min。間羥基聯(lián)苯比色法可快速準(zhǔn)確地測定XG注射液的標(biāo)示量百分含量，該法操作簡單且可靠性好。主要的質(zhì)量檢查項(xiàng)目為:性狀、鑒別、檢查(pH值、吸光度、滲透壓摩爾濃度、Mr與Mr分布、細(xì)菌內(nèi)毒素及注射劑項(xiàng)下的各項(xiàng)目檢查)

9、和含量測定。質(zhì)量檢查結(jié)果表明，XG注射液的各項(xiàng)考察指標(biāo)均達(dá)到或優(yōu)于與XG性質(zhì)、用途相似的SH注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論:確定了XG注射液的配方、制備工藝及含量測定方法，制備了高質(zhì)量XG注射液。確定了XG注射液質(zhì)量檢查項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)，該質(zhì)量控制方法簡單準(zhǔn)確，可全面反映產(chǎn)品質(zhì)量。
　　 3.黃原膠注射液的安全性評價
　　 目的:評價兔膝骨關(guān)節(jié)腔注射XG的安全性及XG對兔軟骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性。方法:在兔膝骨關(guān)節(jié)腔注射2％、1％和0.5％(

10、w/v)的XG注射液及等量生理鹽水(normalsaline，NS)，注射劑量為兔每千克體重0.1mL，每周注射1次，連續(xù)5周。檢測兔膝關(guān)節(jié)寬度、血液學(xué)和血液生化參數(shù)并觀察肝、腎、膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化。采用機(jī)械分離法和酶消化法從兔膝關(guān)節(jié)軟骨中分離軟骨細(xì)胞，在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，采用甲苯胺藍(lán)、番紅-O和Ⅱ型膠原免疫熒光法鑒定軟骨細(xì)胞。經(jīng)不同濃度XG(10～2000μg/mL)作用后，采用四甲基偶氮唑鹽(3-

11、(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium-bromide，MTT)法檢測軟骨細(xì)胞增殖，用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissueinhibitorofmetalprotease-1，TIMP-

12、1)的含量。結(jié)果:與NS組比，不同劑量XG組兔膝關(guān)節(jié)寬度、血液學(xué)及血液生化參數(shù)等均無明顯改變(P＞0.05);肝、腎及關(guān)節(jié)組織未見明顯病理改變(P＞0.05)。本課題成功分離和培養(yǎng)了兔軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)及生長情況均符合軟骨細(xì)胞特征。細(xì)胞被甲苯胺藍(lán)染成藍(lán)色，被番紅-O染成紅色且在胞漿及胞膜Ⅱ型膠原免疫熒光染色陽性表達(dá)，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。兔軟骨細(xì)胞在含10～2000tg/mL的XG培養(yǎng)液中生長活躍，與在不含XG培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細(xì)

13、胞比，細(xì)胞增殖率并未有明顯變化(P＞0.05)，培養(yǎng)液中MMP-1、-3、-13及TIMP-1的含量也未發(fā)生明顯改變(P＞0.05)。結(jié)論:在兔膝關(guān)節(jié)腔注射XG(0.5％～2％)0.1mL/kg，每周1次，連續(xù)5周，全身及局部未見明顯毒性作用。XG(10～2000μg/mL)不會對體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒作用。
　　 4.黃原膠注射液對實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎的藥效和作用機(jī)制研究
　　 目的:制備體內(nèi)和體外OA模型，考察

14、XG對實(shí)驗(yàn)性O(shè)A的療效和作用機(jī)制。方法:將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為4組，分別在第1、3和5d于右膝關(guān)節(jié)腔注射2％、5％、10％(w/v)木瓜蛋白酶和0.03mol/LL-半胱氨酸混合溶液0.1mL/kg以及等量NS(空白對照組)。整個實(shí)驗(yàn)過程觀察兔狀態(tài)并記錄體重和膝關(guān)節(jié)寬度。首次注射后第2、4、6周將兔分批處死，取造模側(cè)股骨髁、脛骨平臺及滑膜做大體及組織病理學(xué)觀察，并進(jìn)行評分，評價不同濃度木瓜蛋白酶引起的兔膝OA模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，于左

15、膝關(guān)節(jié)腔注射含碘乙酸鈉(monosodiumiodoacetate，MIA)3mg、2mg、1mg的NS溶液60μL及等量NS(空白對照組)。造模后分別于第3、7、14、21、28、35、42、49d進(jìn)行大鼠疼痛行為學(xué)測試，包括承重測試和機(jī)械縮足閾值(paw、withdrawalthreshold，PWT)測試。處死大鼠后取造模側(cè)股骨髁和脛骨平臺做大體及組織病理學(xué)觀察，并進(jìn)行評分，評價不同劑量MIA引起的大鼠膝OA模型。將實(shí)驗(yàn)兔右膝關(guān)節(jié)

16、腔注射2％木瓜蛋白酶造模。造模后將兔分為3組:NS組兔右膝關(guān)節(jié)腔注射NS，0.1mL/kg，1次/周，連續(xù)5周;SH組兔右膝關(guān)節(jié)腔注射1％SH，0.1mL/kg，1次/周，連續(xù)5周;XG組兔在第2和4周右膝關(guān)節(jié)腔注射1％XG，0.1mL/kg，在第1、3和5周注射等量NS;所有兔左膝關(guān)節(jié)腔注射NS，0.1mL/kg，1次/周，連續(xù)5周，作為假手術(shù)組(sham組)。整個實(shí)驗(yàn)過程觀察動物狀態(tài)，測量造模側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度。治療結(jié)束后用ELISA法檢

17、測關(guān)節(jié)滑液中白介素1β(interleukin-1，IL-1β)、腫瘤壞死因子僅(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)及前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)的含量，用硝酸還原酶法檢測關(guān)節(jié)滑液中一氧化氮(nitricoxide，NO)的含量，對股骨髁和脛骨平臺軟骨及滑膜做大體及組織病理學(xué)觀察并評分，用二甲基亞甲藍(lán)法測定關(guān)節(jié)軟骨中糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)的含量，用脫氧核糖

18、核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyltransferasemediatednickendlabeling，TUNEL)評價關(guān)節(jié)軟骨中的細(xì)胞凋亡率，用免疫組化及Western-blot法測定關(guān)節(jié)軟骨中MMP及TIMP-1的蛋白表達(dá)，通過RT-PCR法測定關(guān)節(jié)軟骨中MMP及TIMP-1的mRNA含量，綜合評價XG注射液對兔膝OA的藥效和作用機(jī)制。用MIA3mg誘導(dǎo)大鼠OA模型。造模后將大

19、鼠分為4組，分別為注射XG2次組，注射SH2次組，注射SH5次組和注射NS對照組。造模后第14、35d，XG2次組與SH2次組分別注射XG和SH注射液(1％，w/v)0.1mL，第21、28、42d注射等量NS。SH5次組與NS組于造模后第14、21、28、35、42d分別注射SH和NS。采用大鼠模型研究中的方法對各組疼痛指標(biāo)及關(guān)節(jié)軟骨破壞程度進(jìn)行評估，評價XG對大鼠OA關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用及對疼痛的緩解作用。采用小鼠扭體試驗(yàn)和毛細(xì)血管通

20、透性試驗(yàn)評價XG對小鼠的鎮(zhèn)痛作用及對腹腔毛細(xì)血管通透性的影響。用IL-1β(10ng/mL)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞作為OA的體外模型，給予不同濃度XG(10～2000μg/mL)干擾后，采用MTT法檢測軟骨細(xì)胞增殖，采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP及TIMP-1含量，評價XG對兔OA軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果:對兔OA模型研究結(jié)果表明，各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)寬度均于首次注射木瓜蛋白酶后第2周顯著增長，并隨木瓜蛋白酶劑量的增高而增大，但

21、之后各組均有不同程度緩解;軟骨和滑膜的破壞程度隨木瓜蛋白酶劑量的增高和造模時間的延長而加重。對大鼠OA模型研究結(jié)果表明，關(guān)節(jié)腔注射MIA會引起大鼠后足支撐力的顯著下降，也會導(dǎo)致PWT明顯降低，且此兩項(xiàng)指標(biāo)的降低程度與MIA的用量呈正相關(guān)。其中MIA3mg與MIA2mg所引起的疼痛行為改變最為顯著，疼痛可維持至第49d，而MIA1mg引起的疼痛會逐漸緩解;大鼠造模側(cè)膝關(guān)節(jié)破壞程度則隨MIA劑量的增高和造模時間的延長而加重。對兔OA的藥效評

22、價結(jié)果表明，與NS組比，兔膝骨關(guān)節(jié)腔注射XG能保護(hù)軟骨，抑制兔膝OA中軟骨降解，降低膝關(guān)節(jié)寬度、關(guān)節(jié)滑液中IL-1β、TNF-α、PGE2、NO的含量及關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1、-3含量，提高OA關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞存活率、GAG含量及TIMP-1表達(dá)量。而且，注射XG5周2次與注射SH5周5次對關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)效果無顯著性差異。對大鼠OA的藥效評價結(jié)果表明，與NS組比，大鼠骨關(guān)節(jié)腔注射XG對大鼠OA具有較長效的疼痛緩解作用，對關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)

23、作用，可減輕軟骨降解，延緩OA進(jìn)程。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NS組比，腹腔注射XG能顯著延長醋酸致小鼠疼痛的潛伏期，減少扭體次數(shù);而且XG能顯著抑制醋酸引起的小鼠毛細(xì)血管通透性的增加。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1β能誘發(fā)軟骨細(xì)胞損傷，抑制軟骨細(xì)胞增殖，并提高培養(yǎng)液中MMP-1、-3和-13的含量，降低培養(yǎng)液中TIMP-1的含量。XG(100～2000μg/mL)能保護(hù)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，減輕IL-1β對軟骨細(xì)胞的損傷，降低培養(yǎng)液中MMP-1、

24、-3和-13的含量，提高細(xì)胞增殖存活率及培養(yǎng)液中TIMP-1的含量，并且XG在100～1000μg/mL濃度范圍內(nèi)的保護(hù)效果呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論:兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射2％、5％、10％的木瓜蛋白酶和大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1.7％、3.3％、5％的MIA均可制備不同嚴(yán)重程度的OA模型，這兩種模型建模周期短且重現(xiàn)性好。藥效學(xué)評價結(jié)果表明，XG能減輕醋酸致小鼠疼痛并抑制小鼠毛細(xì)血管通透性的增加;XG也能保護(hù)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，減輕IL-1β對軟骨細(xì)胞