p55PIK-NFκB通路在炎癥調(diào)控中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要分三部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分蛋白 p55PIK對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用
　　目的:磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白家族(PI3Ks)蛋白同免疫反應(yīng)密切相關(guān),其調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位的表達(dá)缺失或應(yīng)用相應(yīng)的PI3Ks抑制劑能夠?qū)γ庖叻磻?yīng)產(chǎn)生顯著影響。其中,IA類PI3Ks調(diào)節(jié)亞單位能夠通過其i-SH2結(jié)構(gòu)域同相應(yīng)的催化亞單位形成二聚體結(jié)構(gòu),進(jìn)而調(diào)控催化亞單位的激酶活性。目前關(guān)于IA類PI3Ks亞單位對免疫反應(yīng)尤其是炎癥反應(yīng)的調(diào)

2、控作用存在較多爭議,本論文旨在明確IA類PI3Ks調(diào)節(jié)亞單位p55PIK對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用,初步探討蛋白p55PIK對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用的機(jī)制。
　　方法:擴(kuò)增并純化表達(dá)蛋白p55PIK的腺病毒載體,在HaCat細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)蛋白p55PIK;通過在PMA誘導(dǎo)后的THP1細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染蛋白p55PIK特異性的siRNA,降低蛋白p55PIK的表達(dá)。通過單獨(dú)影響蛋白p55PIK的表達(dá)或者再次給予LPS(脂多糖)刺激,通過Q-PCR檢測相

3、應(yīng)促炎細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6的轉(zhuǎn)錄水平的變化;通過ELISA試驗(yàn)檢測相應(yīng)促炎細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6的蛋白水平的變化;通過Western Blot檢測NFκB信號通路,PI3K/AKT通路,IKK信號通路以及MAPK信號通路的激活情況。
　　結(jié)果:成功擴(kuò)增并純化表達(dá)蛋白p55PIK的腺病毒載體,成功篩選出蛋白p55PIK特異性的siRNA。在HaCat細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)高表達(dá)p55PIK或者再次給予LPS

4、刺激后均能夠顯著促進(jìn)炎癥因子轉(zhuǎn)錄和翻譯(P<0.05),能夠激活NFκB信號通路和PI3K/AKT通路,但對IKK信號通路以及MAPK信號通路無明顯影響;在THP1細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)低表達(dá)p55PIK或者再次給予LPS刺激后均能夠顯著抑制炎癥因子轉(zhuǎn)錄和翻譯(P<0.05),能夠抑制NFκB信號通路和PI3K/AKT通路的激活,但對IKK信號通路以及MAPK信號通路無明顯影響。
　　結(jié)論:p55PIK能夠通過激活NFκB信號通路促進(jìn)免疫細(xì)胞

5、炎癥因子轉(zhuǎn)錄和翻譯。高表達(dá)p55PIK能夠促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子轉(zhuǎn)錄,翻譯以及NFκB信號通路和PI3K/AKT通路激活。低表達(dá)p55PIK能夠抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子轉(zhuǎn)錄翻譯,以及減少NFκB信號通路和PI3K/AKT通路的激活。
　　第二部分p55PIK對炎癥調(diào)控的相關(guān)機(jī)制初步研究
　　目的:初步探討蛋白 p55PIK對炎癥調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:構(gòu)建高表達(dá)蛋白 p55PIK的載體pcDNA3.1-p55PI

6、K,構(gòu)建NFκB RelA報(bào)告基因載體。通過在Hela細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染NFκB RelA報(bào)告基因載體,同時(shí)低表達(dá)或者高表達(dá)蛋白p55PIK,觀察蛋白p55PIK對NFκB RelA轉(zhuǎn)錄活性的影響。通過pcDNA3.1-p55PIK在Hela細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)蛋白p55PIK,通過p55PIK腺病毒載體在HaCat細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)蛋白p55PIK。通過胞核胞漿分離試劑盒將細(xì)胞內(nèi)核漿組分區(qū)別,Western Blot檢測胞核胞漿內(nèi)蛋白p55PIK表達(dá)情況,

7、NFκB信號通路以及PI3K/AKT信號通路激活情況。通過免疫共沉淀尋找免疫過程可能與蛋白p55PIK相結(jié)合的NFκB信號通路蛋白。
　　結(jié)果:成功高表達(dá)蛋白p55PIK的載體pcDNA3.1-p55PIK,構(gòu)建NFκB RelA報(bào)告基因載體。蛋白p55PIK能夠促進(jìn)NFκB RelA轉(zhuǎn)錄活性,能夠正向調(diào)控LPS誘導(dǎo)的NFκB RelA轉(zhuǎn)錄激活。在Hela細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)蛋白p55PIK能夠促進(jìn)胞漿蛋白IKBα的降解,在HaCat細(xì)胞

8、內(nèi)高表達(dá)蛋白p55PIK能夠促進(jìn)胞核蛋白IKBα的降解同時(shí)促進(jìn)胞漿NFκB p65磷酸化的增加。免疫過程例如pV,PMA作用細(xì)胞可能促進(jìn)蛋白p55PIK與NFκB信號通路蛋白NFκB p65結(jié)合。
　　結(jié)論:蛋白 p55PIK能夠通過促進(jìn)NFκB RelA轉(zhuǎn)錄活性,正向調(diào)控炎癥反應(yīng)。蛋白p55PIK與NFκB信號通路蛋白NFκB p65可能在免疫過程例如pV,PMA作用中相互結(jié)合。
　　第三部分穿膜融合多肽 IP55在炎癥治

9、療中的初步應(yīng)用研究
　　目的:觀察穿膜融合多肽IP55預(yù)處理對免疫細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞系以及原代單核巨噬細(xì)胞)相應(yīng)促炎因子產(chǎn)生的影響以及相關(guān)信號通路激活的影響。觀察穿膜融合多肽IP55預(yù)處理對LPS誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞促炎因子釋放的影響。初步探索穿膜融合多肽IP55體內(nèi)的炎癥治療作用。
　　方法:構(gòu)建穿膜融合多肽IP55的原核表達(dá)載體,利用蛋白質(zhì)純化技術(shù)和內(nèi)毒素去除技術(shù)純化穿膜融合多肽IP55,以穿膜融合多肽IP55作用于單核巨噬細(xì)

10、胞系以及原代單核巨噬細(xì)胞后觀察對相應(yīng)促炎因子 TNF-α, IL-6以及IL-1β產(chǎn)生的影響以及相應(yīng)信號通路的變化。動物實(shí)驗(yàn)觀察穿膜融合多肽IP55預(yù)防性治療對LPS誘導(dǎo)的急性小鼠肝損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建穿膜融合多肽IP55的原核表達(dá)載體pTAT-N15,在血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系Jurkat以及實(shí)體腫瘤Hela,IP55均能夠高效進(jìn)入細(xì)胞,抑制腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制細(xì)胞內(nèi)DNA合成;在單核巨噬細(xì)胞系THP1中,穿膜融

11、合多肽IP55預(yù)處理對促炎因子產(chǎn)生無明顯影響(P>0.05),對NFκB信號通路無激活,但能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞THP1促炎因子 TNF-α, IL-6以及IL-1β產(chǎn)生(P<0.05),部分抑制對NFκB信號通路的激活;在原代單核巨噬細(xì)胞內(nèi)能夠部分抑制LPS誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞THP1促炎因子TNF-α產(chǎn)生(P<0.05),對其他促炎因子產(chǎn)生影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,穿膜融合多肽IP55能夠部分抑制LP

12、S誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞NFκB p65的核轉(zhuǎn)位,降低LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷造成的小鼠死亡率。
　　結(jié)論:穿膜融合多肽IP55能有效進(jìn)入細(xì)胞,抑制腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程,抑制DNA合成;在單核巨噬細(xì)胞系采用穿膜融合多肽IP55預(yù)處理能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎因子TNF-α, IL-6以及IL-1β產(chǎn)生;在原代單核巨噬細(xì)胞采用穿膜融合多肽IP55預(yù)處理能夠部分抑制LPS誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞THP1促炎因子TNF-α產(chǎn)生;在LPS誘導(dǎo)的小鼠