雄烯二酮11α羥化的球孢白僵菌菌株篩選及其轉(zhuǎn)化工藝研究.pdf

1、雄甾-4-烯-3，17-雙酮(1，簡稱雄烯二酮或4AD)是甾體藥物的重要中間產(chǎn)物，其微生物羥化物11α-OH-AD目前主要是制成治療高血壓和心血管疾病的藥物9，11位的環(huán)氧化物的醫(yī)藥中間體。在半化學(xué)合成甾體藥品的過程中，4AD經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化11α-羥基化是最關(guān)鍵的步驟之一，是半化學(xué)合成的首要攻克目標(biāo)。本課題以真菌為主進(jìn)行了轉(zhuǎn)化甾體4AD的菌種篩選和轉(zhuǎn)化條件的研究，以期獲得具有工業(yè)生產(chǎn)價值的轉(zhuǎn)化菌株和工藝。 本論文對4AD經(jīng)微生物轉(zhuǎn)

2、化11α-羥基化工藝進(jìn)行了研究，主要包括微生物轉(zhuǎn)化4AD的11α-羥基化菌株的篩選及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定、球孢白僵菌轉(zhuǎn)化4AD的11 α-羥基化工藝優(yōu)化。 本實驗通過對30株真菌轉(zhuǎn)化4AD甾體類化合物能力的篩選，初篩獲得對4AD具有轉(zhuǎn)化能力的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)11株，煙曲霉(AspergillusFumigatu)1株。對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分離并鑒定得到4個產(chǎn)物，分別為：11α-羥基-雄甾-4-烯-3，17-

3、雙酮(2)，6β，110α-雙羥基-雄甾-4-烯-3，17-雙酮(3)，11 α-羥基-睪丸酮(4)和6β，11α-雙羥基睪丸酮(5)。通過結(jié)構(gòu)分析確認(rèn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中存在目標(biāo)產(chǎn)物11β-OH-AD。再以目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率為篩選模型，對有轉(zhuǎn)化能力的菌株的進(jìn)行檢測，復(fù)篩結(jié)果顯示球孢白僵菌MEL15對4AD的110α-羥基化能力較強(qiáng)。 對篩選出的球孢白僵菌MEL15的培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究。對培養(yǎng)基組成優(yōu)化后，得到的最佳培養(yǎng)基配方

4、(g/L)：葡萄糖30，玉米漿20，K<,2>HPO<,4>·3H<,2>O1，MgSO<,4>·7H<,2>O 0.5，F(xiàn)eSO<,4>·2H<,2>O 0.02，pH 6.0。對搖瓶裝液量，菌齡，接種量的研究發(fā)現(xiàn)，以菌體液接種時，接種量10％(V/V)，裝液量40 ml/250 ml，菌齡為48 h時得到11α-OH-AD的轉(zhuǎn)化率為43％，比未優(yōu)化的轉(zhuǎn)化率提高了20％左右。對球孢白僵菌MEL15轉(zhuǎn)化4AD為11α-OH-AD的轉(zhuǎn)化條

5、件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時間控制在60 h較好，以甲醇為助溶劑通透細(xì)胞能力強(qiáng)，助溶劑甲醇終濃度和底物濃度分別為2.5％(V/V)和2.5 g/L時，對優(yōu)化的工藝條件驗證，得到11α-OH-AD的轉(zhuǎn)化率為65％，比培養(yǎng)條件優(yōu)化后的提高了51.2％。 本章通過將4AD類似物作為外源物質(zhì)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，再對其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分析，推測分析球孢白僵菌MEL15的催化酶系對底物4AD的類似物也具有C1