轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄甾烯酮菌株的篩選鑒定及發(fā)酵工藝的研究.pdf

1、雄甾—4—烯-3，17—二酮(AD)和雄甾-1，4—烯-3，17—二酮(ADD)可以作為幾乎所有甾體激素類藥物不可替代的中間體，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。本文研究的核心是分離、篩選一株性能良好的菌株，能夠轉(zhuǎn)化植物甾醇(Plantsterol)生產(chǎn)AD與ADD，確立適宜的分析測定方法，確定最佳發(fā)酵條件、合適的工藝參數(shù)、最優(yōu)培養(yǎng)基、摸索底物的投加方式，從而為將來的工業(yè)化生產(chǎn)做一些基礎(chǔ)性工作。主要研究內(nèi)容包括以下幾個方面： 確立了

2、分析測定植物甾醇側(cè)鏈降解過程中底物植物甾醇和產(chǎn)物AD及ADD的方法。采用薄板層析的方法成功的分離了底物與產(chǎn)物，從而能快速簡便的監(jiān)測底物的消耗與產(chǎn)物的生成情況。根據(jù)產(chǎn)物AD與ADD在紫外區(qū)的吸收情況，利用254nm與298nm雙波長測定AD與ADD的生成量。采取比色法對底物植物甾醇進行了定量測定，高效液相色譜法能對產(chǎn)物精確的測定，液質(zhì)聯(lián)用法可以對產(chǎn)物分子量進行了確定。所確立的分析方法對植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化的分析與工廠進行監(jiān)測提供了較好的指導(dǎo)

3、。 從分離的200多株菌中篩選出將一株高效轉(zhuǎn)化植物甾醇為AD與ADD的菌株ST06—95。對該菌進行了形態(tài)、生理生化的研究，并用16SrDNA的方法對其進行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株ST06—95可以利用多種碳源，不利用纖維素，可以水解淀粉。將該菌的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列對比，發(fā)現(xiàn)其序列與Bacillus屬BacillusAmyloiquefaciens的16SrDNA序列相似性最高，達到99.9％，初步將該

4、菌命名為BacillusAmyloiquefaciensST06—95。 以菌株BacillusspST06—95為出發(fā)菌株對植物甾醇進行選擇性側(cè)鏈降解制備AD和ADD。對轉(zhuǎn)化條件如底物濃度、投料方法、投料時間進行了摸索，對發(fā)酵初始pH、轉(zhuǎn)化時間、發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基組成等進行了優(yōu)化。結(jié)果表明用0.4％的Tween80配合超聲波溶解、底物濃度為0.5％、菌體未生長時投加底物轉(zhuǎn)化效果最佳。最佳發(fā)酵條件為：初始pH7.0、接種量

5、12％、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間168h，發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油與葡萄糖的含量為1:4。在最佳轉(zhuǎn)化條件下產(chǎn)物ADD與AD的得率從優(yōu)化前的29.5％提高到42.5％，其中ADD與AD的含量比值大約10：1。 在搖瓶實驗的基礎(chǔ)上，進行了5L罐擴大培養(yǎng)實驗，在培養(yǎng)過程中保持轉(zhuǎn)化溫度為30℃，通過調(diào)節(jié)空氣流量與攪拌轉(zhuǎn)速保持充足的供氧，5L罐轉(zhuǎn)化時間減少為144h。結(jié)果顯示投料量為0.5％，底物轉(zhuǎn)化率為99％，ADD與AD總得率為45％以上；投