富油底棲硅藻的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化.pdf

1、本文以掛板法采集溫州市洞頭海區(qū)野生底棲硅藻，分離出16株底棲硅藻，經(jīng)培養(yǎng)后對藻細(xì)胞進行尼羅紅染色觀察，初步篩選出9株油球較大的藻株，然后進一步開展培養(yǎng)和油脂測定實驗，最終篩選出兩株生長較快、含油量較高的底棲硅藻——咖啡雙眉藻Amphora coffeaeformis和縊縮菱形藻Nitzschia constricta。以該兩株底棲硅藻為對象，探討了尼羅紅染色法檢測硅藻油脂相對含量的最優(yōu)條件和氮、磷、硅、植物激素吲哚乙酸IAA和脫落酸AB

2、A、固定化對其繁殖生長和油脂積累的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　1.富油底棲硅藻的分離純化和篩選
　　采用掛板法獲得野生底棲硅藻，平板分離法和水滴分離法相結(jié)合分離純化得16株底棲硅藻，其中菱形藻屬5種、雙眉藻屬3種、舟形藻屬3種、羽紋藻屬2種、曲殼藻屬2種、擬菱形藻屬1種。硅藻細(xì)胞經(jīng)尼羅紅染色熒光顯微鏡觀察，初步篩選得9種油體占藻細(xì)胞體積較大的藻株，其中菱形藻屬3種、雙眉藻屬3種、舟形藻屬2種、羽紋藻屬1種。根據(jù)9株微藻的比

3、平均生長速率和總脂含量的乘積，最終篩選出2株生長快、含油量高的底棲硅藻——咖啡雙眉藻 Amphora coffeaeformis和縊縮菱形藻Nitzschia constricta作為實驗藻株。
　　2.硅藻細(xì)胞尼羅紅染色的條件優(yōu)化
　　尼羅紅（Nile Red）是一種脂溶性的熒光染料，細(xì)胞經(jīng)尼羅紅染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到金黃色熒光。尼羅紅染色熒光檢測微藻中油脂的相對含量的方法，其最佳條件因儀器和藻種差異會有所不同，選

4、擇合適的染色條件對更準(zhǔn)確快捷測定微藻油脂相對含量十分重要。為優(yōu)化兩株藻株的尼羅紅熒光光譜法測定油脂含量的最適條件，本試驗通過對兩種藻株中性脂發(fā)射峰、尼羅紅濃度、染色時間、細(xì)胞密度的探索，得出了本實驗對象兩株藻株的尼羅紅熒光光譜法測定油脂的最適條件為：中性脂發(fā)射峰575nm、尼羅紅濃度1μg/ml、染色時間6min、細(xì)胞密度OD680＜0.5。
　　3.氮、磷、硅對兩株底棲硅藻繁殖生長及油脂含量的影響
　　采用光密度法和尼羅紅

5、染色法分別測定了氮、磷、硅對底棲硅藻咖啡雙眉藻Amphora coffeaeformis和縊縮菱形藻Nitzschia constricta的繁殖速度和油脂積累的影響。結(jié)果顯示：2種底棲藻在NO3-N濃度為1.746 mg/L時，細(xì)胞均無明顯繁殖生長，且在實驗第7天開始死亡，當(dāng) NO3-N濃度繼續(xù)升高后，細(xì)胞繁殖速度開始加快，當(dāng)NO3-N濃度達8.820 mg/L后，硅藻細(xì)胞的繁殖速度不再明顯加快。
　　在實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，2

6、種硅藻的繁殖速度均隨H2PO4-P濃度升高而加快，但當(dāng)H2PO4-P濃度達到0.884 mg/L后，硅藻細(xì)胞的繁殖速度不再明顯加快；
　　在實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，2種底棲硅藻均隨SiO3-Si濃度增加而加快，但SiO3-Si濃度對2種底棲硅藻細(xì)胞繁殖速度影響并不顯著。
　　3種元素對2種底棲硅藻繁殖速度的影響力：N＞P＞Si。實驗期間，2種底棲硅藻的油脂含量均呈先降后升的變化規(guī)律，油脂的積累主要集中在實驗后期，氮磷硅限制均能

7、促進2種底棲硅藻細(xì)胞油脂的積累，對2株底棲硅藻細(xì)胞油脂積累的影響程度，氮限制比磷和硅限制都要大。
　　4.植物激素IAA和ABA對兩株底棲硅藻生長及油脂含量的影響
　　為探索植物生長激素對底棲硅藻繁殖生長和油脂積累的影響，作者以咖啡雙眉藻和縊縮菱形藻為材料設(shè)計了不同濃度 IAA和ABA對兩種底棲硅藻繁殖生長和油脂積累影響的培養(yǎng)實驗。結(jié)果表明：低濃度的IAA和ABA能夠明顯促進兩株藻的生長，高濃度則會抑制生長，兩株微藻最適宜I

8、AA和ABA濃度有所不同：低濃度的IAA對兩株底棲硅藻的生長能起到明顯的促進作用，0.5mg/L時效果最為明顯；IAA濃度為2 mg/L組的細(xì)胞密度反而低于對照組的細(xì)胞密度；在對數(shù)生長期向培養(yǎng)基中添加低濃度（0-1.0 mg/L）的ABA能夠有效促進兩株底棲硅藻的生長，而高濃度（＞1.0 mg/L）的ABA則抑制了2株底棲硅藻細(xì)胞的繁殖生長。向培養(yǎng)基中添加適量的IAA（濃度為0.5 mg/L）能顯著促進兩株微藻的油脂積累；ABA在低濃度

9、（＜1.0mg/L）能顯著促進兩株微藻油脂的積累。
　　5.固定化對兩株底棲硅藻繁殖生長及油脂含量的影響
　　為探討固定化培養(yǎng)對底棲硅藻繁殖生長和油脂積累的影響，對篩選出的兩種富油底棲硅藻進行了固定化培養(yǎng)試驗。結(jié)果表明：咖啡雙眉藻固定化對繁殖生長影響不大，固定化組與空白對照組硅藻的繁殖生長情況基本上無差異，最終細(xì)胞密度無顯著差異。與咖啡雙眉藻不同，縊縮菱形藻固定化后，初期有一個延緩期，然后加快，且到第19d仍保持較快的生長速