局部高溫對青春期前大鼠睪丸支持細胞的影響及其與生精細胞凋亡關系的研究.pdf

1、背景:
　　近幾十年來人類的生殖功能不斷退化,男性精子數(shù)量和質(zhì)量有明顯下降趨勢,研究發(fā)現(xiàn),世界成年男性的精子密度在過去50年里下降了近一半,平均每年下降約1％;研究表明,造成其急劇下降的因素與環(huán)境污染加劇有很大關系;近來,人們對環(huán)境干擾物、生活飲食方式及環(huán)境溫度等對男性生殖功能影響的認識日益深入。大量研究證實,隱睪癥患者、長期穿牛仔褲或高溫作業(yè)下的青年男子的生育力出現(xiàn)明顯下降,表明哺乳動物睪丸需要一個比腹腔溫度低的適宜環(huán)境才能正常

2、發(fā)育;溫度作為一種外在因素引起男性不育逐漸受到重視;而當前臨床應用的男性避孕方法如輸精管結扎術等都存在不同程度的副作用,促使研究者尋找更加安全有效的方法,提高睪丸局部溫度作為抗精子發(fā)生的方法則為研究男性避孕提供了一條新思路;但目前對高溫引起的生精障礙機制研究仍較少。本研究采用高溫處理未成年動物睪丸的模型,從細胞及分子水平探討高溫作用后生精功能障礙的機理,并對高溫引起不育的機制進行深入研究;這些研究對阻止、延緩或減弱上述因素對人類生育能力

3、的損害有重要意義,同時也為臨床治療一些男性不育、指導未成年男性生殖保健和探索男性避孕措施的研究提供理論基礎。
　　目的:
　　1)研究高溫對青春期前大鼠睪丸生精細胞的影響,闡明高溫引起生精障礙的早期機制;
　　2)探討局部高溫誘導的睪丸支持細胞波形蛋白表達與分布改變與生精細胞凋亡間的關系,闡明支持細胞在高溫誘導生精障礙中的作用;
　　3)研究睪丸生精細胞Caspase-3在高溫作用后的表達分布情況,闡明Caspa

4、se-3在高溫誘導生精細胞凋亡中的作用,同時探討其與支持細胞波形蛋白分布及表達改變的關系。
　　材料與方法:
　　健康4~6周齡青春期前雄性 SD大鼠,標準實驗房適應性喂養(yǎng)一周,給以規(guī)律光照(12h:12h)、自由進食飲水。將大鼠隨機分為對照組(8只)和實驗組(32只),實驗組按高溫處理后2、4、12和24小時均分成4個亞組(n=8)。通過對睪丸局部高溫(43℃水浴15分鐘)處理,對照組浸于22℃水浴15分鐘于24小時后處死

5、;分別于處理后各時間點頸椎脫臼處死,收集標本。采用組織化學和免疫組織化學方法,分析高溫對青春期前 SD大鼠睪丸曲細精管細胞形態(tài)結構、支持細胞波形蛋白及生精細胞 Caspase-3蛋白表達與分布的影響,采用紫外分光光度法檢測睪丸組織Caspase-3的活性;同時,應用Western blot蛋白免疫印跡技術定量檢測波形蛋白表達情況;采用 TUNEL法及流式細胞儀檢測各組的生精細胞凋亡情況;采用微粒子化學發(fā)光法檢測各組睪丸內(nèi)睪酮含量。

6、>　　結果:
　　1.組織學觀察與睪酮含量:處理后2 h即可見少量生精細胞脫落至管腔,4 h組可見大量生精細胞脫落,生精細胞與曲細精管基底膜之間形成較大空隙;12 h組可見管腔脫落細胞消失,生精上皮變薄,生精細胞稀疏、排列紊亂,支持細胞胞質(zhì)呈空泡樣改變;24 h損害較12 h更為嚴重,多數(shù)管腔可見多核巨細胞。高溫作用后睪丸內(nèi)睪酮含量在12 h及24 h與對照組比較均減少,其中24 h組明顯下降(P<0.05)。
　　2.生精

7、細胞凋亡情況:
　　1)TUNEL法檢測:對照組可見睪丸生精上皮排列完整規(guī)則,存在較多的自發(fā)性細胞凋亡,主要集中在精原細胞及部分精母細胞;高溫處理2及4h后凋亡數(shù)與對照組比較反而減少(P<0.01),各組凋亡細胞主要定位在初級精母細胞及精原細胞;12 h組生精細胞凋亡主要集中在生精周期的Ⅰ~Ⅳ期(早期)和Ⅻ~ⅩⅣ期(晚期),而Ⅴ~Ⅶ期(中期)凋亡少見;24 h組見大部分曲細精管均出現(xiàn)細胞凋亡,數(shù)目明顯增多;12 h及24 h組凋亡

8、指數(shù)與對照組比較明顯增加(P<0.01)。
　　2)流式細胞儀檢測:對照組可見凋亡峰,高溫處理后2及4 h凋亡峰反較對照組下降,而在高溫處理后12及24 h組,凋亡峰明顯升高,甚至成為主峰;高溫處理后2及4 h組亞單倍體細胞百分率與對照組比較降低(P<0.05),而12及24 h組與對照組比較明顯升高(P<0.01)(Control:10.41±1.91,2 h:7.64±2.78,4 h:7.40±3.25,12 h:20.46

9、±5.13,24 h:30.98±9.96)。且12及24 h組4C峰較前幾組降低比較明顯(P<0.01),2C峰變化不明顯,1C峰逐漸降低。
　　3.波形蛋白(Vimentin)表達與分布情況:
　　1)免疫組化:對照組波形蛋染色可見陽性沿基底膜形成棕色的環(huán),并隨支持細胞胞質(zhì)呈輻射狀伸向管腔;2h組可見其圍繞支持細胞核周表達,與對照組比較伸至管腔的波形蛋白微絲表達減少或消失;圖像分析顯示,2 h組與對照組比較蛋白表達無明顯

10、差異,而12及24 h組與對照組比較差異顯著(P<0.01),4 h組較2 h組蛋白表達增加(P<0.01),4 h組與12 h組及24 h組與12 h組間蛋白表達比較無差異。
　　2)Western blot免疫印跡法:2 h組與對照組比較蛋白表達無明顯差異,4 h組較對照組蛋白表達增加(P<0.05),而12及24 h組與對照組比較差異顯著(P<0.01);顯示各組波形蛋白表達量與免疫組織化學所得結果基本相符。
　　4.

11、 Caspase-3蛋白表達與分布及活性變化情況:高溫處理后在2及4 h均可見表達,陽性細胞數(shù)逐漸增多,這時仍見大多數(shù)表達在胞漿內(nèi),主要集中在精母細胞表達,在脫落于管腔中的精子細胞核周也可見其表達;至高溫處理后12及24 h,在精母細胞和精子細胞的胞核出現(xiàn)Caspase-3強陽性表達,圖像分析顯示:除2 h組與對照組比較染色陽性細胞 Caspase-3含量無差別外,其它各組均升高(P<0.05);高溫處理各組陽性細胞表達率與對照組比較均

12、增多(P<0.01),同時活性檢測結果與上述基本相符。
　　結論:
　　1.高溫作用可在短期內(nèi)引起青春期前大鼠生精過程損傷,生精細胞凋亡增加可能是造成這種損傷的機制之一。
　　2.支持細胞波形蛋白對維持生精上皮結構的完整性有重要作用;高溫可能通過直接作用支持細胞,造成支持細胞波形蛋白的表達及分布改變進而破壞生精過程,可能解釋高溫導致生精障礙的早期機制。
　　3. Caspase-3表達及分布的改變可能與支持細胞波